膜异位hMSH2分子促进γδT细胞对肺癌细胞的体外细胞毒活性

摘要

人γδT细胞是T淋巴细胞中的一个特殊亚群，具有天然免疫细胞的诸多特征，是联系固有免疫和适应性免疫应答的桥梁，在机体免疫监视和抗肿瘤免疫应答过程中发挥重要的作用。γδT细胞因其主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)非限制性的、广谱的肿瘤抗原识别模式、快速活化的效应机制、强大的细胞毒作用和多种抗肿瘤效应性细胞因子的分泌能力，在肿瘤的免疫细胞治疗中备受重视。
　　γδT细胞可直接识别多种抗原分子，研究最多的是小分子磷酸盐抗原，基于磷酸化抗原扩增Vγ9Vδ2T细胞的过继细胞治疗早已进入临床Ⅰ/Ⅱ期试验。此外，γδT细胞还可识别一些应激条件诱导的、在细胞表面异位表达的蛋白类配体。本课题组前期研究成果表明，人MutS同源蛋白2（Human MutS homologue2，hMSH2）是γδT细胞识别的肿瘤相关蛋白类抗原。
　　hMSH2分子是DNA错配修复系统的一个重要成员，主要在细胞质中合成，与系统其他成员hMSH3或hMSH6分子形成异源二聚体进入细胞核中，参与损伤或错配的DNA的修复过程。在多种肿瘤的发生发展过程中，均可以检测到hMSH2基因突变或蛋白功能异常。本实验室在前期工作中采用基于T细胞受体(T cell receptor，TCR)δ链的互补决定区3（Complementary determining region3，CDR3）结合特性的筛选策略，筛选到hMSH2分子是γδT细胞识别的肿瘤相关配体。进一步研究发现，hMSH2分子在多种肿瘤细胞膜表面呈广泛的、不同水平的异位表达。除了肿瘤之外，在病毒感染及氧化应激的情况下，hMSH2分子也能异位表达于细胞膜表面。膜异位表达的hMSH2分子被γδT细胞受体(γδT cell receptor，TCRγδ)和NK细胞受体成员2D(Natural killer group2member D，NKG2D)双重识别后，参与介导γδT细胞对靶细胞的杀伤或清除作用。但是，目前异位表达的hMSH2分子介导γδT细胞杀伤肿瘤细胞的相关机制仍不清楚，澄清hMSH2分子介导γST细胞杀伤肿瘤细胞的相关机制，有助于进一步揭示γδT细胞在肿瘤免疫监视及抗肿瘤免疫中的重要作用。另外，研究hMSH2分子在促进γδT细胞细胞毒活性方面的效应，对于优化基于γδT细胞的肿瘤过继免疫治疗策略具有重要意义。
　　本研究通过构建hMSH2分子过表达的肺癌细胞模型，探索膜表面异位表达的hMSH2分子介导γδT细胞杀伤肺癌细胞的相关机制，并研究hMSH2分子在促进γδT细胞的细胞毒活性方面的效应。首先，检测了4种常用的人肺癌细胞系(NCI-H520，GLC-82，NCI-H1703及NCI-H446)及人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞表面膜hMSH2分子的异位表达水平。结果发现，不同肺癌细胞系膜表面hMSH2的表达情况差异较大，从中选择了细胞膜表面hMSH2分子低表达的NCI-H520细胞作为构建过表达hMSH2分子的肺癌细胞模型。利用构建的重组表达载体cFugw-hMSH2转染NCI-H520细胞，瞬时表达hMSH2-EGFP融合蛋白。结果发现，转染后NCI-H520细胞膜表面的hMSH2分子水平显著上调，阳性细胞比例从原先的12.67±0.80％升高到62.53±8.22％。体外细胞毒活性实验结果显示，hMSH2分子在NCI-H520细胞细胞膜异位表达水平的升高能有效增强γδT细胞对其的细胞毒活性。在检测对杀伤过程中γδT细胞的活化及细胞毒相关效应分子的水平时发现，在与过表达hMSH2的NCI-H520细胞相互作用后，γST细胞活化相关分子CD69和CD107a的表达水平显著升高，并分泌更多的抗肿瘤细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。这一结果提示，hMSH2分子可能是通过促进γδT细胞的活化、脱颗粒作用及抗肿瘤细胞因子IFN-γ与TNF-α的分泌来增强γδT细胞对肺癌细胞NCI-H520的体外细胞毒活性。另外，还发现，经小分子磷酸盐抗原唑来膦酸(Zoledronic acid，ZOL)处理后，γδT细胞对NCI-H520细胞的杀伤活性增加，并且呈现一定的剂量依赖性;同时，在相同条件的唑来膦酸预处理组中，γδT细胞对hMSH2分子膜异位表达上调的NCI-H520细胞的杀伤效率明显高于对野生型NCI-H520细胞。由此可见，hMSH2分子在促进γδT细胞体外杀伤肺癌细胞系NCI-H520细胞的活性方面，与唑来膦酸存在协同效应，提示二者能协同用于抗肿瘤免疫治疗。
　　综上，本研究得出以下主要结论:1、细胞膜异位表达的hMSH2分子参与介导γδT细胞对肺癌细胞的细胞毒作用，其膜异位水平与γδT细胞对靶细胞的杀伤作用成正相关;2、膜异位hMSH2分子介导γδT细胞杀伤肺癌细胞的机制可能与促进γδT细胞活化及分泌抗肿瘤细胞因子IFN-γ与TNF-α有关;3、膜异位hMSH2分子在促进γδT细胞体外杀伤肺癌细胞的过程中与磷酸化抗原存在协同作用。

目录

摘要

英文缩略词表

前言

技术路线

一、主要细胞系

二、主要试剂

三、主要抗体

四、主要材料

五、主要仪器设备

六、主要试剂盒

七、主要PCR引物

八、主要载体

九、试剂配制

方法

一、人外周血单个核细胞(PBMC)的分离

二、肺癌细胞系及正常细胞表面hMSH2分子水平

三、真核细胞中扩增hMSH2编码序列

四、构建cFugw-hMSH2真核表达载体

五、cFugw-hMSH重组质粒转染293T细胞

六、质粒转染293T细胞后Western blot鉴定hMSH2蛋白

七、体外扩增的γδT细胞杀伤hMSH2膜异位表达上调的NCI-H520细胞

八、γδT细胞杀伤hMSH2膜异位表达上调的肺癌细胞过程中效应分子水平的变化

九、γδT细胞体外杀伤唑来膦酸(ZOL)预处理的NCI-H520细胞

结果

一、多种人肺癌细胞系细胞膜上hMSH2分子表达水平

二、构建cFugw-hMSH2重组载体

三、构建hMSH2分子过表达的肺癌细胞模型

四、γδT细胞对hMSH2分子过表达的肺癌细胞模型的体外细胞毒实验

五、γδT细胞体外杀伤hMSH2分子过表达的肺癌细胞模型的分子机制

六、hMSH2分子协同磷酸盐抗原促进γδT细胞体外的细胞毒效应

讨论

结论

参考文献

文献综述

个人简历

致谢

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