β—乳球蛋白源ACE抑制活性肽的研究

摘要

用蛋白的浓度与纯度为指标，比较研究了硫酸铵沉淀加凝胶层析法和高盐低pH条件下透析法两种技术路线分离纯化β-乳球蛋白的效果；以β-乳球蛋白水解后的ACE抑制率为指标，对胰蛋白酶酶解β-乳球蛋白的条件进行优化；用阳离子交换树脂和大孔树脂DA201-C对β-乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液进行脱盐处理，并选用Sephadex G-25和Sephadex G-15串联分离得β-乳球蛋白源ACE抑制肽。
　　 1．硫酸铵沉淀加凝胶层析法分离β-乳球蛋白。以乳清粉为原料，用70％硫酸铵沉淀初步分离乳清蛋白，再选用SephadexG-50凝胶层析柱在pH6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液条件下以1.0rpm的洗脱速度洗脱收集目标峰。结果表明：硫酸铵沉淀加凝胶层析法所得β-乳球蛋白浓度为1mg/ml、纯度>90％。
　　 2．高盐低pH条件下透析法分离β-乳球蛋白。以乳清粉为原料，选用7％的NaCl在pH为2的条件下初步沉淀分离乳清蛋白，再用高速离心机在10000×g重力下离心分离20min，最后用分子截量为14000Da的透析袋放于30倍体积的蒸馏水中静置20小时，收集透析袋中的溶液。结果表明：高盐低pH条件下透析法所得β-乳球蛋白浓度为11mg/ml、纯度达90％左右。
　　 3．制备β-乳球蛋白源ACE抑制生物活性肽的酶解方式和条件优化。采用胰蛋白酶，中性蛋白酶，胃蛋白酶水解β-乳球蛋白制备ACE抑制肽，通过体外检测法测定其ACE抑制率。结果表明，胰蛋白酶水解物的ACE抑制率最大。采用三因素二次旋转正交试验对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解条件进行优化，研究了底物浓度、温度、酶与底物的质量比对ACE抑制率的影响，建立了回归方程：Y=50.62-2.33X1-1.97X2+5.81X3-3.36X2X3-6.56X22-1.96X32，分析了各因素对ACE抑制率的影响，确定了最优的水解条件为：水解温度40℃，底物质量浓度为60g/L，酶与底物的质量比为3％。在胰蛋白酶最优的水解条件下酶解，水解6h时水解物ACE抑制率最大。
　　 4．β-乳球蛋白源ACE抑制生物活性肽的分离纯化。试验首先选择阳离子交换树脂和大孔树脂DA201-C对具有较高ACE抑制活性的β-乳球蛋白源活性肽进行脱盐。结果表明：阳离子交换树脂脱盐率86.67％，大孔树脂DA201-C脱盐率83.33％。但大孔树脂DA201-C脱盐处理后的水解物ACE抑制活性提高了约50％。因此，大孔树脂DA201-C为β-乳球蛋白水解物比较理想的脱盐方法：选择具有分子筛作用的Sephadex G-25和Sephadex G-15串联分离具有较高ACE抑制活性的β-乳球蛋白源活性肽。在洗脱流速为0.7ml/min时，选用0.01mol/L、0.03mol/L、0.06mol/L三种不同离子强度的磷酸盐缓冲液进行洗脱分离，筛选出能够较好分离β-乳球蛋白源ACE抑制肽的条件。结果表明：0.03mol/L离子强度的pH8.3的磷酸盐缓冲液进行洗脱，可从水解物中分离得到4个组分峰，其第4组分峰对ACE的抑制活性最大，抑制率为87.54％。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

引言

1材料与方法

1.1试验材料与仪器

1.1.1试验材料

1.1.2主要试剂

1.1.3主要试验仪器

1.2试验时间地点

1.3试验设计与试验方法

1.3.1两种分离β-乳球蛋白的方法

1.3.2 β-乳球蛋白的水解

1.3.3 β-乳球蛋白水解物的分离纯化

1.3.4分离纯化产物的液相检测

1.4测定指标与方法

1.4.1蛋白纯度的检测

1.4.2 β-乳球蛋白含量的测定

1.4.3 ACE制制率的体外检测方法

1.4.4盐浓度的测定

2结果与分析

2.1 β-乳球蛋白的分离

2.1.1硫酸铵沉淀加凝胶层析法的分离效果

2.1.2高盐低pH条件下透析法的分离效果

2.1.3两种方法分离效果比较

2.2 β-乳球蛋白的水解

2.2.1不同蛋白酶水解β-乳球蛋白产物的ACE抑制率

2.2.2胰蛋白酶水解β-乳球蛋白的单因素试验

2.2.3水解温度，底物浓度和酶与底物的质量比对β-乳球蛋白水解物ACE抑制率的影响

2.2.4温度-底物浓度对水解物ACE抑制率的影响

2.2.5温度-酶与底物的质量比对水解ACE抑制率的影响

2.2.6底物浓度-酶与底物的质量比对水解物ACE抑制率的影响

2.2.7胰蛋白酶最优水解条件的优化

2.2.8水解时间对水解物ACE抑制率的影响

2.3 β-乳球蛋白水解物的分离纯化

2.3.1 β-乳球蛋白水解物的脱盐

2.3.2 Sephadex G-25分离ACE抑制活性肽

2.3.3 Sephadex G-15分离ACE抑制活性肽

2.3.4 Sephadex G-25和Sephadex G-15串联分离ACE抑制活性肽条件的筛选

2.3.3分离纯化的ACE抑制活性肽的液相检测

3讨论

3.1 β-乳球蛋白的分离

3.1.1硫酸铵沉淀加凝胶层析法

3.1.2高盐低pH条件下透析法

3.2制备β-乳球蛋白源ACE抑制肽工具酶的选择

3.3目标活性肽的分离和纯化

3.3.1 ACE抑制肽的脱盐

3.3.2 ACE抑制肽的分离

3.4目标分离肽的电泳分析

3.5目标分离肽的液相色谱分析

4结论

参考文献

附录 本论文所用缩写词

致 谢

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