丝胶蛋白源ACE抑制多肽的筛选及其抑制机理研究

摘要

本文为了从家蚕蚕丝的丝胶蛋白酶解液中筛选ACE抑制多肽，具体研究内容主要包括三部分:(1)通过对蚕丝的脱胶工艺的优化获得丝胶蛋白;(2)运用理论分析与体外实验相结合的方式从丝胶蛋白酶解液中筛选ACE抑制多肽;(3)通过亲疏水性不同的高交联聚合物对丝胶蛋白酶解液中的ACE抑制多肽的初步筛选。主要研究成果如下:
　　(1)研究结果得出在温度121℃，0.2Mpa的压力下，料液比为1∶30的高温高压下对蚕丝脱胶2h，脱胶率高达29.5％左右，其中丝胶蛋白的蛋白质含量高达96.8％。
　　(2)运用理论酶切点分析与实验验证相结合筛选出高活性的ACE抑制的丝胶蛋白酶解液，再基于C端氨基酸对ACE抑制活性起重要作用的策略，构建QSAR模型并预测得出丝胶蛋白酶解液中ACE抑制多肽的活性并通过合成多肽实验验证发现其预测准确性大于75％以上(log IC50＜0.7)，该方法实现了对ACE抑制多肽的快速、高通量的筛选。同时对合成多肽中活性差异最大的两个多肽(SSR和SSK)进行抑制机理分析，通过实验分析Lineweaver-Burk曲线显示两个多肽与ACE的抑制都为竞争性抑制，再通过分子对接分析发现多肽的C端含有更多的H键受体更容易与ACE活性口袋中的关键氨基酸形成氢键，因此会具有更高ACE抑制活性，从而解释了SSR(IC50=42.6μM)比SSK(IC50=239.9μM)具有更高的ACE抑制活性的原因。
　　(3)通过亲疏水性不同的高交联聚合物(HCP-Ben、HCP-Th和HCP-Py)对丝胶蛋白酶解液的选择性吸附来进行ACE抑制多肽的初步筛选。吸附后通过体外活性实验证实，通过HCP-Ben吸附48h后的酶解液的ACE抑制活性增加，IC50值从49.98mg/L降为37.04mg/L;通过HCP-Th和HCP-Py吸附后平衡后的酶解清液的ACE抑制活性降低，分别为80.40mg/L和60.64mg/L。达到了初步筛选的目的，为进一步纯化分离奠定良好的理论基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 丝胶蛋白简介

1．1．1 蚕丝的组成

1．1．2 丝胶蛋白成分

1．1．3 丝胶蛋白的研究现状

1．2 降血压多肽研究现状

1．2．1 高血压现状

1．2．2 血压调节机理

1．2．3 降血压多肽的研究现状

1．2．4 酶抑制动力学

1．3 ACE抑制多肽筛选方式

1．3．1 ACE抑制多肽传统分离手段现状

1．3．2 基于蛋白氨基酸序列筛选抑制多肽

1．3．3 新型吸附分离材料富集纯化抑制多肽

1．4 多肽抑制活性预测以及抑制机理研究

1．4．1 定量构效关系预测多肽抑制活性

1．4．2 抑制机理研究

1．5 高交联化合物(HCP)的研究现状

1．6 选题意义与主要研究内容

1．6．1 选题意义与目的

1．6．2 主要研究内容

引言

2．1 实验试剂与仪器

2．1．1 实验试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 蚕丝脱胶方法

2．2．2 测定丝胶蛋白含量

2．2．3 水解酶的筛选

2．2．4 丝胶蛋白酶解实验

2．2．5 ACE抑制活性测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 Na2CO3脱胶工艺考察

2．3．2 高温高压脱胶工艺考察

2．3．3 酶的筛选

2．3．4 丝胶蛋白酶液的活性

2．4 本章小结

引言

3．1 实验试剂与仪器

3．1．1 实验试剂

3．1．2 实验仪器

3．2 实验部分

3．2．1 分析Ser1根据PeptideCutter获得的多肽

3．2．2 QSAR建模

3．2．3 LC-MS分析丝胶蛋白酶解液

3．2．4 QSAR预测以及体外活性测定

3．2．6 分子对接

3．3 结果与讨论

3．3．2 最优模型的选择

3．3．3 模型验证

3．3．4 最优模型色块图分析

3．3．5 LC-MS分析酶解液

3．3．6 QSAR预测丝胶蛋白多肽的ACE活性

3．3．7 体外合成验证

3．3．8 多肽抑制类型

3．3．9 分子对接分析

3．4 本章小结

第四章 高交联聚合物(HCPs)对丝胶蛋白酶解液中ACE抑制多肽的初步筛选

引言

4．1 实验仪器

4．1．1 实验试剂

4．1．2 实验仪器

4．2 实验部分

4．2．1 HCPs的合成

4．2．2 比表面积和孔径分布

4．2．3 扫描电子显微镜(SEM)

4．2．4 傅里叶红外变换(FTIR)

4．2．5 HCPs吸附实验

4．2．6 测定HCPs吸附后的ACE抑制活性

4．3 结果与讨论

4．3．1 比表面积以及孔隙结构分析

4．3．2 HCPs的SEM表征

4．3．3 FTIR光谱分析

4．3．4 HCPs吸附实验

4．3．5 HCPs吸附后酶解液活性的变化

4．4 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

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