牛肉风味强化肽在酿酒酵母中的克隆和表达

摘要

牛肉风味强化肽（BeefyMeatyPeptide，BMP）最初是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到的一种八肽。经研究分析证明，BMP与食盐、味精有较好的协同呈味作用，能增强牛肉风味，并且具有良好的热稳定性，可以满足食品工业生产的热处理要求。因此BMP有潜力成为新一代风味强化剂。本课题在实验室已构建的BMP组成型表达载体pGAP9-16BMP，并在毕赤酵母PichiapastorisGS115(pGAP9-16BMP)中成功表达BMP基础上，采用基因工程方法在酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中组成型表达BMP，利用酿酒酵母代替毕赤酵母作为宿主菌，以食品级菌株作为宿主菌，保证了表达产物的安全性。
　　以工程菌PichiapastorisGS115（pGAP9-16BMP）基因组DNA为模板PCR扩增PGAP-16BMP，以Scerevisiae基因组为模板PCR扩增终止子CYC1，并将扩增得到的产物克隆于YEp352质粒上，构建成组成型表达载体YEp352-16BMP。将质粒YEp352-16BMP经醋酸锂法转化到S.cerevisiaeW303-1A中，最终通过尿嘧啶营养缺陷型平板筛选和进一步的PCR验证，得到能够分泌表达16BMP的酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)。
　　优化工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)摇瓶发酵培养条件。通过单因素实验，找出影响作用较大的三个因素为葡萄糖、YP浓度和培养基初始pH值。通过正交试验选择出了最佳的摇瓶发酵条件水平组合:即葡萄糖浓度为3％(w/v)，YP浓度为1.5×，初始pH为5.0。经过优化后，30℃发酵48h时，BMP在摇瓶水平获得最高表达量可达190mg/L。
　　在5L发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵优化酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)组成型表达BMP。分批发酵时，发酵液中BMP在36h时获得最大表达量为180mg/L。补料分批发酵时，采用分别在发酵至12h、15h、18h、21h、24h时恒速流加8g/L葡萄糖溶液，总糖质量浓度为70g/L的补料策略，在发酵48h时，菌体数目比分批发酵时提高了近一倍，BMP在36h时获得最高表达量为253mg/L。
　　发酵液经过煮沸，离心取上清，先通过截留分子量为60kDa的中空纤维进行初步纯化，经截留分子量为6000Da的中空纤维进行浓缩纯化，最后将3.5L发酵上清液浓缩为350mL。初步分离纯化得到了16拷贝的BMP目的产物。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 生物活性肽

1．1．1 生物活性肽的分类

1．1．2 生物活性肽的特点

1．2 食品感官肽

1．2．1 肽呈味作用的特点

1．2．2 肽呈味功能的多样性

1．3 牛肉风味强化肽

1．4 生物活性肽的生产方法

1．4．1 生物活性肽的传统生产方法

1．4．2 生物技术生产风味肽的研究进展

1．4．3 生物技术生产牛肉风味强化肽的研究进展

1．5 酿酒酵母表达系统

1．5．1 酿酒酵母表达系统的特点

1．5．2 酿酒酵母的常用载体

1．5．3 酿酒酵母的筛选标记和转化

1．5．4 影响酵母表达外源蛋白的因素

1．5．5 表达蛋白的纯化方法

1．6 重组酵母菌的组成型表达

1．6．1 优化重组酵母菌摇瓶发酵条件

1．6．2 重组酵母菌的高密度发酵表达

1．8 本课题研究的目的与研究内容

1．8．1 研究的目的和意义

1．8．2 研究的主要内容

1．8．3 主要技术路线图

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种与质粒

2．1．2 试剂

2．1．3 工具酶及DNA、蛋白质Marker

2．1．4 抗生素

2．1．5 实验仪器

2．1．6 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 标准溶液的配制

2．2．2 组成型表达载体YEp352-16BMP的构建

2．2．3 酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp-16BMP)的构建

2．2．4 工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)发酵表达BMP

3 结果与讨论

3．1 YEp352-16BMP表达载体的构建

3．1．1 PCR扩增pGAP9-16BMP片段和酿酒酵母终止子CYC1

3．1．2 YEp352-16BMP表达载体的构建

3．2 酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)构建结果分析

3．3 酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)摇瓶发酵条件的研究

3．3．1 种子质量的研究

3．3．2 酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)摇瓶发酵培养基的研究

3．3．3 酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)摇瓶发酵条件的研究

3．3．4 酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)摇瓶发酵的优化

3．4 发酵罐发酵表达BMP

3．4．1 葡萄糖标准曲线的测定

3．4．2 W303-1A(YEp352-16BMP)在5L发酵罐中的分批培养

3．4．3 W303-1A(YEp352-16BMP)在5L发酵罐中的补料分批培养

3．5 16BMP在发酵液中的稳定性

3．6 中空纤维超滤浓缩发酵液中的BMP

4 结论

4．1 表达载体YEp352-16BMP的构建

4．2 工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)的构建

4．3 工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)摇瓶培养的研究

4．4 工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)高密度发酵的研究

4．4．1 分批发酵

4．4．2 补料分批发酵

4．5 中空纤维超滤膜浓缩发酵液中蛋白

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢