Ⅱb类细菌素PlnJ和PlnK的异源表达和抗菌活性研究

摘要

细菌素是人类研究较为深入的微生物防御物质，具有种类多样，来源丰富，无毒高效等特点。随着化学防腐剂的泛滥和抗生素耐药病原菌的出现，安全高效的细菌素在食品防腐、医疗保健以及动物饲料行业具有巨大的潜力。到目前为止，只有nisin一种细菌素被商业化应用于食品防腐行业，且存在抑菌谱窄，只能抑制部分革兰氏阳性菌的缺陷。因此开发其他广域抑菌的细菌素就非常有必要。
　　本文的实验对象是Ⅱb类细菌素PlnJ/K，其中多肽PlnJ含有25个氨基酸，多肽PlnK含有32个氨基酸。当这两个不同的多肽协同作用时，抑菌活性将明显增强。本实验室筛选得到一株具有广谱抗菌性的植物乳杆菌ZJ316，在其全基因组序列中的植物乳杆菌素基因簇中发现细菌素基因plnJ和plnK，并在大肠杆菌中成功地表达这两个基因。通过一系列的分离纯化得到目标蛋白，并对目标蛋白进行了初步的抗菌活性研究。具体内容如下:
　　1)设计plnJ和plnK基因合成序列，在两个基因的5'端添加一个肠激酶酶切位点，目的是为了表达目标蛋白后，用肠激酶酶切，能得到未经任何修饰的成熟肽PlnJ和PlnK。
　　2)设计引物，对合成基因plnJ和plnK进行PCR扩增，将扩增产物与表达载体pET-32a进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，构建pET-32a-plnJ和pET-32a-plnK重组表达质粒。将重组质粒转化至表达菌株BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达，SDS-PAGE验证重组蛋白pET-32a-PlnJ和pET-32a-PlnK被顺利诱导。
　　3)为减少包涵体的产生，将重组表达菌株BL21-pET-32a-plnJ和BL21-pET-32a-plnK在1 mM IPTG，16℃，160 rpm的条件下过夜诱导表达，菌体超声破碎后离心收集上清。
　　4)超声破碎上清为含有组氨酸标签的融合蛋白pET-32a-PlnJ和pET-32a-PlnK的粗提液，通过镍柱吸附融合蛋白，利用咪唑与组氨酸标签竞争镍柱的结合位点，洗脱得到的融合蛋白即为纯度较高的重组蛋白，脱盐浓缩后，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白的浓度，分别为880μg/mL和720μg/mL。肠激酶酶切得到两种蛋白PlnJ和PlnK，分子量的大小分别为2.9 kDa和3.5 kDa，用10 kDa超滤离心管离心收集分子量小的蛋白，即滤液中含有目标蛋白PlnJ和PlnK。
　　5)对分离得到的目标蛋白PlnJ和PnK进行抑菌活性研究，指示菌为大肠杆菌和单增李斯特菌，采用牛津杯双层平板抑菌法和96孔板抑菌法。在双层平板抑菌法中，单独的PlnJ或PlnK没有非常明显的抑菌作用，而PlnJ和PlnK等量混合液PlnJK呈现出明显的抑菌圈;在96孔板法中，不同浓度的PlnJ、PlnK以及PlnJK对指示菌显示出不同的抗菌活性，其中PlnJK的抗菌活性远远大于单独地PlnJ或PlnK。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 乳酸菌

1．1．1 乳酸菌及分类

1．1．2 乳酸菌的益生作用

1．2 细菌素

1．2．1 细菌素简介

1．2．2 细菌素的分类

1．2．3 细菌素的抑菌机制

1．3 细菌素PlnJ和PlnK

1．3．1 植物乳杆菌素基因簇介绍

1．3．2 细菌素PlnJ和PlnK的研究现状

1．3．3 植物乳杆菌ZJ316的PlnJ和PlnK氨基酸序列分析

1．4 本课题的研究和意义

1．4．1 本课题的研究意义与目的

1．4．2 研究主要内容及技术路线

第二章 plnJ和plnK原核表达菌株的构建和表达

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 菌种

2．1．2 质粒

2．1．3 培养基

2．1．4 主要药品和试剂

2．1．5 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 目的片段和引物的设计与合成

2．2．2 plnJ和plnK的原核表达载体构建

2．2．3 目的片段和质粒载体的双酶切

2．2．4 目的片段和质粒载体的双酶切产物回收

2．2．5 目的片段和质粒载体连接

2．2．6 连接产物的转化

2．2．7 阳性转化子的筛选

2．2．8 plnJ和plnK的原核表达菌的构建

2．2．9 诱导表达

2．3 实验结果

2．3．1 目的片段plnJ和plnK的PCR扩增

2．3．2 双酶切载体和目的片段

2．3．3 双酶切产物回收

2．3．4 重组质粒中目的基因测序结果

2．3．5 SDS-PAGE检验

2．4 本章小结

第三章 细菌素PlnJ和PlnK的分离纯化

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 试剂与耗材

3．1．3 实验仪器和设备

3．2 实验方法

3．2．1 重组表达菌的扩大培养

3．2．2 重组蛋白粗提液的制备

3．2．3 Tricine-SDS-PAGE检验目的蛋白

3．2．4 Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白

3．2．5 重组蛋白脱盐处理

3．2．6 重组蛋白含量测定

3．2．7 酶切重组蛋白

3．2．8 超滤离心管收集目标蛋白

3．3 实验结果和分析

3．3．1 重组蛋白的大量诱导表达和分离

3．3．2 蛋白摩尔量的计算

3．3．3 酶切及目标蛋白回收

3．3．4 Tricine-SDS-PAGE检验

3．4 本章小结

第四章 plnJ和plnK的抑菌效果初探

4．1 实验材料和仪器

4．1．1 实验菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 主要材料

4．1．4 主要仪器和设备

4．2 实验方法

4．2．1 样品的处理

4．2．2 抑菌圈实验

4．2．3 96孔板板抑菌实验

4．3 实验结果和讨论

4．3．1 样品浓度

4．3．2 抑菌圈实验结果

4．3．3 96孔板实验结果和分析

4．4 本章小结

第五章 总结和展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

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