人脂联素基因的克隆、表达及其生物活性检测

摘要

在过去的20多年，不论是发达国家还是发展中国家，超重和肥胖已成流行态势，与之相关的2型糖尿病、心血管疾病和高血压等疾病的发病率也不断攀升。因此人们把目光转向了在这些疾病中扮演着重要角色的脂肪组织，随着大量脂肪细胞因子的发现，脂肪组织作为一种重要的内分泌器官开始为人们所关注和重视。脂联素是脂肪细胞分泌的蛋白，具有抗胰岛素抵抗、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化的作用。 在对脂联素近十年的研究中发现，低脂联素水平不仅与胰岛素抵抗以及2型糖尿病相关，低脂联素血症还可出现在心血管疾病、高血压、血脂异常等疾病中。血清脂联素水平检测可以做为胰岛素抵抗和代谢综合征的预测指标；研究者认为，血中脂联素水平检测与糖化血红蛋白检测一样具有相同的重要性。因此血浆脂联素水平将是辅助诊断代谢性疾病以及评价某些抗糖尿病药物疗效的极佳的实验室检测指标。 脂联素是一种良好的胰岛素增敏剂，其可直接作用于肝脏、骨骼肌，增强胰岛素的敏感性。体外实验研究还发现，脂联素是G6Pase的抑制剂，重组的脂联素蛋白，可作用于体外培养的肝细胞，抑制糖异生，减少肝糖输出。 研究目的：1.克隆和表达全长的脂联素蛋白，以得到纯化的重组蛋白和抗脂联素的多克隆抗体。2.观察重组脂联素蛋白对大鼠原代肝细胞G6Pase转录水平的影响，检测重组蛋白的生物活性。 实验方法：1.从人的脂肪组织中提取总RNA,利用RT-PCR的方法得到人脂联素基因全序列，构建pMD18-T/adiponectin载体，经PCR反应使脂联素DNA片段两端加上attB位点，将目的序列通过BP以及LR反应克隆到表达载体pET-DEST42中，目的序列经过测序鉴定；重组的阳性表达质粒命名为pET-DEST42/adiponectin。将重组质粒转化入DE3(BL21)感受态细胞中，IPTG诱导表达。超声碎菌，处理包涵体，在变性条件下纯化蛋白，蛋白利用NDSB201结合谷胱苷肽复性、透析除盐并超滤浓缩。蛋白纯度经SDS-PAGE鉴定，Bradford法蛋白定量 2.重组蛋白通过背部皮内多点注射的方法，免疫兔子，每次蛋白量为100ug，8周后，颈静脉取血，离心得到抗血清，用琼脂双扩散法测抗体滴度。3.大鼠原代肝细胞培养4小时后，在培养液中加入重组脂联素，作用24小时，提取RNA，半定量RT-PCR的方法来测定重组蛋白对肝细胞G6Pase表达水平的影响。实验结果：1.得到脂联素表达载体pET-DEST42/adiponectin经测序证实其插入的目的片段无误。2.得到纯化复性后的重组蛋白以及兔抗人脂联素抗血清。3.体外实验证实重组脂联素具备生物活性。重组脂联素蛋白作用于大鼠原代肝细胞，浓度到达2000ng/ml即可抑制G6Pase的转录水平。 实验结论：利用Gateway表达体系可以快速准确地获得重组表达载体，与传统方法比较，这个表达体系效率较高，但不同的蛋白还是需要慎重选择合适的融合标签和表达载体。 重组的全长脂联素蛋白在2000-5000ng/ml浓度范围内都可使葡萄糖-6-磷酸酶转录水平下降，在5000ng/ml时，可使转录水平下降约40％。因此重组脂联素具有一定的生物活性，脂联素可以通过降低G6Pase的转录水平，抑制糖异生的关键酶葡萄糖-6-磷酸酶的生成，抑制糖异生来减少肝糖输出。

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