乳酸片球菌细菌素的分离纯化及理化性质研究

摘要

细菌素是食品级微生物的代谢产物，有的细菌素已作为食品防腐剂用于提高食品的安全性。本研究的目的是以从国内发酵食品中分离出的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)为研究对象，探索提高其片球菌素产率的培养条件，研究片球菌素的分离纯化技术和活性测定方法，并阐明其抗菌物质的本质和理化特性。 本研究对乳酸片球菌所产的抑菌物质进行H2O2酶处理、酸性产物抑菌作用排除试验和胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K的处理试验，证明该菌所产的抗菌物质，不是H2O2和酸性产物，并且对蛋白酶敏感，因而确认该菌产生的抑菌物质为蛋白质性质的细菌素。将乳酸片球菌接种于MRS培养基，对产生细菌素的条件进行优化，确定其有最大细菌素产量时培养基的初始pH为6.5，静置培养温度为37℃，培养时间为16h。 本研究对几种分离体系进行了摸索比较，最终建立了三步法体系对片球菌素Pediocin进行分离纯化。根据细菌素在pH6.0时与菌体的吸附力最强，pH2.0时吸附力最弱，通过调节pH和离心来收集细菌素。透析并冷冻干燥浓缩后经过SPSepharose Fast Flow阳离子交换柱层析和Sephadex G-50凝胶层析进行纯化，收集有活性的峰。经过分离纯化三步法后，与培养上清液相比，细菌素的最终得率为0.19％，比活为5.17×104AU/mg，纯化了34.54倍。提纯的细菌素样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，出现了单一的条带，这就证明己得到了较纯的细菌素，其大小约为4600Da。 本研究还对片球菌素Pediocin的理化性质作了全面的观察。试验表明，细菌素在20℃-100℃的条件下保温20min活性没有太大变化，具有很高的热稳定性；在pH1-pH14的条件下20℃处理3h抑菌效果稳定，具有良好的耐酸碱特性；经有机溶剂处理过的细菌素样仍能保持较好的抑菌活性，有机溶剂对细菌素活性的影响不显著；冷冻、冷藏后细菌素仍能具有很好的抑菌活性，且冷冻后的活性还要优于冷藏后的效果。 乳酸片球菌细菌素具有被开发为安全和高效生物食品防腐剂的巨大潜力，本研究建立的乳酸片球菌细菌素的分离纯化技术及关于其理化性质探索的研究将为乳酸片球菌细菌素的工业化生产和实际应用提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

声明

第一章 文献综述

1.1课题的研究背景

1.1.1生物食品防腐剂的开发

1.1.2乳酸菌细菌素的开发

1.2细菌素的综述

1.2.1细菌素的定义

1.2.2细菌素的分类

1.2.3乳酸菌细菌素的蛋白质结构

1.2.4细菌素的抑菌谱

1.2.5细菌素的作用机理

1.2.6细菌素在食品中的应用

1.3研究内容与研究方法

1.3.1细菌素的活性测定

1.3.2细菌素效价分析

1.3.3各种因素对细菌素活性的影响

1.3.4细菌素的提取纯化

1.3.5细菌素的理化性质

1.4应用与展望

1.5乳酸菌细菌素研究的目的和意义

第二章细菌素初步鉴定及发酵条件优化

2.1.实验材料与仪器

2.1.1仪器设备

2.1.2菌种

2.1.3培养基

2.1.4药品与试剂

2.2实验方法

2.2.1细菌素的初步鉴定

2.2.2细菌素产生菌发酵条件优化

2.3结果与分析

2.3.1细菌素产生的鉴定

2.3.2最佳产细菌素培养条件的确定

2.4小结

第三章细菌素的分离纯化与分子量测定

3.1实验材料

3.1.1主要仪器

3.1.2主要试剂材料

3.2实验方法

3.2.1细菌素效价分析

3.2.2考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量

3.2.3细菌素的提取

3.2.4细菌素的纯化

3.2.5细菌素分子量测定

3.3结果与讨论

3.3.1效价分析

3.3.2蛋白浓度的测定

3.3.3细菌素的粗提

3.3.4阳离子交换树脂层析

3.3.5凝胶层析

3.3.6细菌素纯化效果

3.3.7细菌素的分子量测定

3.4小结

第四章细菌素的理化性质分析

4.1实验材料

4.1.1主要仪器

4.1.2主要试剂材料

4.2实验方法

4.2.1细菌素耐热性试验

4.2.2细菌素耐酸碱试验

4.2.3细菌素耐有机溶剂试验

4.2.4细菌素对蛋白酶的敏感性试验

4.2.5冷冻冷藏对细菌素活性的影响

4.3结果与讨论

4.3.1细菌素耐热试验结果

4.3.2细菌素耐酸碱试验结果

4.3.3乳酸片球菌细菌素耐有机溶剂试验结果

4.3.4细菌素的蛋白酶敏感性试验结果

4.3.5冷冻、冷藏对细菌素的影响结果

4.4小结

第五章结论

讨论与展望

参考文献

发表论文和科研情况说明

附录：符号说明

致 谢