来源于蒙古传统发酵乳制品中产抑菌素乳酸菌的分离、鉴定、特性研究

摘要

乳酸菌可以产生各类抑菌物质，如酸类物质乳酸和乙酸、过氧化氢、抑菌素等。抑菌素是一类由乳酸菌分泌产生有抑菌作用的蛋白类物质。来源于乳酸菌的抑菌素可作为生物防腐剂应用到食品中，因为乳酸菌通常被作为发酵食品的发酵剂，并且被认为是对人安全的GRAS食品添加剂。抑菌素和抗生素最大的不同是抑菌素严格作用于相关的特定微生物或者是和产抑菌素菌类相近的微生物类群。另一方面，抗生素有更广泛的抑菌谱，且对亲缘关系近的菌株没有选择性。另外，抑菌素是核糖体合成的初级或次级代谢产物，而抗生素通常是初级代谢产物。对于蒙古传统发酵乳制品中产抑菌素乳酸菌的研究还很少。因此，本研究的目的是从蒙古不同地区的发酵乳制品中分离筛选出产抑菌素的乳酸菌，研究不同营养物质的产抑菌素效果的影响，优化培养条件，评价抑菌素对食品腐败菌Listeria monocytogenes和Enterococcus faecalis的抑制作用。在研究中，对乳酸菌的初筛使用含有5％(w/v)CaCO3和0.02%(w/v)溴甲酚紫的改良MRS培养基，对乳酸菌的鉴定采用16 S rRNA基因序列分析的方法，并使用牛津杯法抑菌试验筛选抑菌素生成菌株及测定抑菌素活力。通过pH、温度和酶的作用等因素对抑菌素活力的影响研究抑菌素的特性。研究在极端条件下，如低pH、高胆盐等的耐受程度，产抑菌素活力的变化情况来表明其作为益生菌的特性。使用Plackett-Burman实验设计来优化产抑菌素条件，确定对产抑菌素最重要的影响因素，通过响应面分析建立模型，评价主要的影响因子，确定有显著性的影响因子，选择出产抑菌素的最优条件。本研究的主要结果如下所示：
　　1、来源于蒙古传统乳制品中产抑菌素乳酸菌的分离、筛选与鉴定
　　使用含有5%(w/v) CaCO3和0.02%(w/v)溴甲酚紫的改良MRS培养基对来自蒙古传统乳制品的10种样品进行乳酸菌的分离，通过培养基颜色改变、过氧化氢酶作用和溶钙圈的形成，确定其中六种样品含有乳酸菌。从六种样品中，挑选、纯化出125株革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性菌株。观察单菌株的形态特征，大部分菌株球菌（8株分离自MG2，9株分离自MG6，13株分离MG7，48株分离自MG8，40株分离自MG9，4株分离自MG10），剩下的是杆菌（3株分离自MG6.1）。因此，使用这125株菌进行抑菌素的初筛。结果表明，30株菌具有抑制E.faeacalis VTM2R和L. monocytogenes ATCC19114的活性。同时测定了菌株的无细胞上清液的抑菌效果。在30株菌中，只有MG2-8、MG6-1和MG10-2的无细胞上清液表现出对E.faecalis VTM2R和L. monocytogenes ATCC19114的抑制作用。通过16S rRNA序列分析鉴定这三株菌为Enterococcus durans(MG2-8)，Enterococcus faecium(MG6-1),和Enterococcus durans(MG10-2)。MG2-8的无细胞上清液表现出对E. faecalis和L. monocytogenes最高的抑菌效果，因而选择Enterococcus durans MG2-8，进一步研究其产抑菌素的特性，并优化其产抑菌素的培养条件。指示菌E.faeacalis VTM2R和L.monocytogenes ATCC19114属抑菌素敏感菌株。因此，在这项研究中选择这两株菌作为指示菌。在研究中还测定了E.durans MG2-8生长及产抑菌素情况，结果显示，在培养3h后，进入对数期，细胞密度从0.3增长到对数期末的1.44。在培养2h后当抑菌素活力为60 AU/ml，表现出对E.faecalis VTM2R的抑制作用，当培养到30h，在稳定期内，抑菌素的活力达到最大值为480 AU/ml。
　　2、产抑菌素菌株Enterococcus durans MG2-8的抑菌素特性及益生菌特性
　　酶类对MG2-8产抑菌素的影响作用显示，当加入蛋白分解酶如蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白时，抑菌效果明显减弱，而使用非蛋白分解酶如纤维素酶、溶壁酶作用时，不影响抑菌效果，这表明MG2-8的抑菌作用是因为其产生的蛋白类物质。无细胞上清液（活力为60 AU/ml）在100℃120 min条件，抑菌活力没有明显损失，然而121℃5 min则抑菌活力完全失去。对抑菌素对产生菌细胞的吸附的研究表明，该抑菌素对产生菌的细胞没有吸附作用。100 AU/ml活力的抑菌素对培养2 h的指示菌抑制结果表明，在前10 h能完全抑制指示菌的长，L.monocytogenes ATCC9114和E. faecalis VTM2R两种菌液浓度仅各自分别从0.07到0.08和0.12到0.19(OD600)，到14 h时指示菌开始快速增长，22 h达到对照的标准。细菌素MG2-8通过Tricine-SDS-PAGE测定分子量，染色的一半胶中观察到有两条蛋白质条带，对照另一半覆盖有粪肠球菌VTM2R的BSM软琼脂的胶的抑菌圈的位置，可知细菌素MG2-8的分子量大约为5.8kDa，通过分子量的大小确定了细菌素MG2-8属于II类细菌素。培养条件中NaCl、pH和胆盐浓度对E. durans MG2-8生长的影响表明，该菌可以在9%NaCl的条件下生长，对胆盐耐受性的浓度为0.3%，对pH的耐受范围在2-12之间。
　　3、MG2-8产抑菌素条件优化
　　Plackett-Burman design试验结果表明在经过24 h培养后24种影响因子下的抑菌素活力在60~960 AU/ml的范围内。通过显著性分析，胰蛋白胨、脱脂奶粉和葡萄糖的置信度分别达到95.9%、99.4%和99.6%（p-值<0.05)。然后通过响应面分析法确定显著的影响因子进行评价。使用中心合成设计（CCD）的结果表明，在20种设计中抑菌素的活力在360~960AU/ml的范围内。该模型计算的样本可决系数R2为0.84，这和修正决定系数值很接近，说明得到的二次模型方程有较高的拟合度。响应面分析得到的优化结果和二次模型方程预测的结果很接近。最佳的产抑菌素的条件为胰蛋白胨17.93(g/l)、脱脂奶粉2.06(g/l)和葡萄糖10.62(g/l)，响应面模型预测的产抑菌素活力为972.78 AU/ml。通过进一步的重复验证试验得到该条件下的产抑菌素活力为960 AU/ml和预测的结果较为一致。通过响应面法对产抑菌素菌株培养基成分的优化，产抑菌素活力从480 AU/ml增长到960 AU/ml。上述实验表明，可以通过Plackett-Burman design和响应面分析法（RSM）在对Enterococcus durans MG2-8产抑菌素的培养基成分的优化以提高产抑菌素活力。实验结果也确认了该实验设计及数据分析的可信度与有效性。

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中文摘要

目录

LIST OF ABBREVIATIONS

LIST OF TABLES

LIST OF FIGURES

LIST OF APPENDICES

GENERAL INTRODUCTION

RESEARCH OBJECTIVES

CHAPTER-I Literature Review

1.1 Lactic acid bacteria

1.2 Antimicrobial substances produced from lactic acid bacteria

1.3 Bacteriocin

1.4 Chemical and physical properties of Bacteriocin

1.5 Classification of Bacteriocin

1.6 Bacteriocin synthesis

1.7 Mode of action

1.8 The significant factors for bacteriocin activity

1.9 Using of bacteriocins in foods

1.10 The methods to detection of bacteriocin production

1.11 Microorganisms in milk and milk products

1.12 Lactic acid bacteria in fermented dairy products

CHAPTER-II Isolation of bacteriocin producing lactic acid bacteria from traditional Mongolian fermented dairy products

2.1 Introduction

2.2 Materials and Methods

2.3 Results

2.4 Discussion

CHAPTER-III Characteristics of bacteriocin produced by Enterococcus durans MG2-8 and its probiotic properties

3.1 Introduction

3.2 Materials and Methods

3.3 Results

3.4 Discussion

CHAPTER IV Optimization of medium for bacteriocin MG2-8 production by experimental designs and data analysis

4.1 Introduction

4.2 Materials and Methods

4.3 Results

4.4 Discussion

SUMMARY AND CONCLUSION

参考文献

APPENDICES

PUBLICATION

致谢