酶法制备羊乳酪蛋白ACE抑制肽及分离纯化

摘要

高血压是由人体内的血管紧张素转换酶(agioten sinconverting enzyme，ACE)活性过高所引起的一种常见的慢性疾病。ACE抑制肽是通过抑制ACE的活性，达到降低血压的作用。研究表明，食源性ACE抑制肽，相对于传统的降压药物，具有安全有效、无毒副作用的优势，成为研究热点。近年来，国内外学者对食源ACE抑制肽开展了广泛研究工作，日本已有降压产品上市，而我国尚处于研究阶段。陕西具有丰富的羊乳资源，但羊乳产品种类单一，主要以羊奶粉为主，附加值低，因此开发羊乳酪蛋白ACE抑制肽，对完善羊乳产业多样性，提高附加值具有促进作用。
　　本课题以羊乳为原料，利用等电点沉淀法制备酪蛋白，通过单因素及响应面试验，优化工艺参数;采用不同的蛋白酶对制备的酪蛋白进行水解，以ACE抑制率和水解度（degree of hydrolysis，DH）为指标，优化酶解工艺;将上述最佳酶解条件下得到酪蛋白酶解物，分别通过超滤、大孔吸附树脂、凝胶色谱等手段分离、纯化ACE抑制肽，研究表明:
　　以羊乳为原料、酪蛋白得率为指标，温度、pH、搅拌强度为控制参数，通过单因素及响应面实验，采用等电点沉淀制备酪蛋白，确定的工艺参数为:温度45℃、pH4.6、搅拌强度1200rpm，酪蛋白得率达到1.931g/100mL。
　　以ACE抑制率和水解度为指标，分别采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase及蛋白酶K于最适条件下水解酪蛋白，结果表明，Alcalase为水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的最佳用酶，Alcalase和胰蛋白酶为最佳复合水解酶。
　　对Alcalase水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的过程进行响应面优化，得到的最佳工艺条件为:温度69℃、pH8.95、底物浓度10％、酶添加量5％及水解时间165min，在此条件下，酶解蛋白液的ACE抑制率为90.19％;Alcalase和胰蛋白酶复合水解羊乳酪蛋白的最佳酶解工艺条件:温度69℃、pH8.4、底物浓度12％、复合酶比例为1∶1、酶添加量8.25％、水解时间90min，复合酶解蛋白液的ACE抑制率达到了91.99％。
　　采用Lineweaver-Burk法求得Alcalase单酶水解反应动力学参数为:Km为0.1519mg/mL，Vmax为0.1302mg/mL·min;Alcalase和胰蛋白复合酶水解反应动力学参数为Km为0.1274mg/mL，Vmax为0.1541mg/mL·min。比较单酶与复合酶水解效果发现复合酶水解优于单酶水解。
　　制备的酪蛋白酶解物经截留分子量分别为10kDa、5kDa、1kDa的超滤膜超滤分离，结果表明，超滤膜为1kDa的透过液，ACE抑制率最高，达到89.09％，IC50为0.2983mg/mL。
　　采用大孔吸附树脂DA201-C处理1kDa透过液，调节上样pH4.0，以75％乙醇为洗脱剂，纯化后的ACE抑制率达到了90.12％，IC50为0.257mg/mL，较纯化前均有所提高。
　　通过SephadexG-25纯化上述组分，以蒸馏水为洗脱剂，上样浓度150mg/mL，洗脱剂流速0.8mL/min，在此条件下将酶解物分成三个组分G1、G2、G3，其中G2活性最高，ACE抑制率达到91.23％，IC50为0.175mg/mL。采用SephadexG-15再次纯化分离组分G2得到G2-1、G2-2，其中G2-2活性最高，ACE抑制率达到92.16％，IC50为0.134mg/mL。
　　本课题制备的羊乳酪蛋白ACE抑制肽，具有较高的ACE抑制活性，可以作为添加剂，用于高血压患者降压食品的开发，同时增加了羊乳的经济价值，促进产业的发展。

目录

摘要

1 前言

1．1 高血压与ACE抑制肽

1．1．1 高血压的危害

1．1．2 传统降压药物的危害及食源性ACE抑制肽的优势

1．1．3 ACE抑制肽

1．2 ACE抑制肽的研究进展

1．2．1 ACE抑制肽的制备方法

1．2．2 ACE抑制肽的分离纯化

1．3 本课题的意义及研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料与试剂

2．1．2 仪器设备

2．2 技术路线与试验方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 脱脂乳的制备

2．2．3 酪蛋白提取工艺的优化

2．2．4 酪蛋白最佳用酶的选择

2．2．5 酶解条件的优化

2．2．6 酶解液的超滤分离

2．2．7 大孔树脂DA201-C对酶解物的初步分离

2．2．8 凝胶色谱对酶解物的分离纯化

2．2．9 RP-HPLC法测定肽组成图谱

2．3 分析测定方法

2．3．1 蛋白浓度的测定

2．3．2 多肽浓度的测定

2．3．3 酪蛋白得率的测定

2．3．4 酪蛋白提取率的测定

2．3．5 pH-State法测蛋白质水解度

2．3．6 ACE抑制率的测定

2．3．7 IC50的测定

3 结果与讨论

3．1 酪蛋白提取工艺的优化

3．1．1 蛋白质标准曲线

3．1．2 温度对酪蛋白得率和提取率的影响

3．1．3 不同pH条件下酪蛋白得率和提取率的变化

3．1．4 搅拌强度影响酪蛋白制备的效果分析

3．1．5 酪蛋白提取工艺的优化

3．2 羊乳酪蛋白水解最佳用酶的选择

3．3 单一酶水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的优化

3．3．1 温度对Alcalase水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽效果的影响

3．3．2 pH对Alcalase水解羊乳酪蛋白效果的影响

3．3．3 酶添加量对羊乳酪蛋白酶解物ACE抑制率及水解度的影响

3．3．4 底物浓度对羊乳酪蛋白酶解物ACE抑制率及水解度的效果分析

3．3．5 不同水解时间下ACE抑制率及水解度的变化

3．3．6 Alcalase水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽主要影响因素的筛选

3．3．7 Alealase水解羊乳酪蛋白最佳酶解工艺条件的优化

3．4 复合酶水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的优化

3．4．1 温度对复合酶水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的效果分析

3．4．2 pH对复合酶水解羊乳酪蛋白效果的影响

3．4．3 酶添加量引起ACE抑制率及水解度的变化分析

3．4．4 底物浓度对ACE抑制率及水解度的影响

3．4．5 不同水解时间下ACE抑制率及水解度的变化

3．4．6 复合酶比例对复合酶水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的影响

3．4．7 复合酶水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽主要影响因素的筛选

3．4．8 最陡爬坡试验结果

3．4．9 复合酶水解羊乳酪蛋白最佳酶解工艺条件的优化

3．5 酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的反应动力学

3．5．1 多肽标准曲线

3．5．2 单一酶水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的反应动力学

3．5．3 复合酶水解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的反应动力学

3．6 酪蛋白酶解液的超滤分离

3．7 DA201-C大孔树脂对酶解液的脱盐精制

3．7．1 DA201-C大孔树脂对ACE抑制肽的静态吸附动力学

3．7．2 DA201-C大孔树脂对ACE抑制肽的静态解吸动力学

3．7．3 不同pH值对吸附效果的影响

3．7．4 不同乙醇浓度对解吸效果的影响

3．7．5 大孔吸附树脂DA201-C的动态解吸

3．7．6 大孔吸附树脂DA201-C的洗脱液IC50的测定

3．8 葡聚糖凝胶色谱分离纯化ACE抑制肽

3．8．1 洗脱剂对SephadexG-25分离效果的影响

3．8．2 上样浓度引起SephadexG-25分离效果变化分析

3．8．3 不同洗脱剂流速影响SephadexG-25的分离效果分析

3．8．4 SephadexG-25组分分离

3．8．5 SephadexG-15分离G2组分

3．8．6 SephadexG-15分离组分G2-2的RP-HPLC肽图谱

4 结论、创新点及展望

4．1 结论

4．2 创新点

4．3 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的成果目录

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