低分子量胶原多肽的制备及其抗氧化活性研究

摘要

胶原多肽是由胶原蛋白或明胶酶解得到的多肽混合物，由于胶原多肽有着优良的营养特性和生理活性，因此在食品行业和化妆品行业有着广泛的应用前景。在化妆品中，多肽分子量是影响生物活性的最重要的因素，以往用胶原蛋白酶解制备胶原小分子多肽:酶解产物分子量分布较广、大分子胶原多肽含量较高，束缚了胶原多肽在化妆品中的应用。本论文采用多酶复合酶解法，对明胶进行酶解，极大的提高了酶解效率，解决了小分子胶原多肽得率低，酶解分子量分布不集中等问题。
　　本论文以明胶为研究对象，采用三步复合酶解法制备分子量主要在1000 Da以下的小分子活性多肽。用单因素实验对胶原多肽水解工艺进行优化，并测定了明胶和水解胶原多肽的基本组成成分。研究其清除自由基的能力，并在此基础上进行动物实验，最终确定小分子胶原多肽的抗氧化特性。本文的研究内容体现在以下几方面:
　　1.采用碱性蛋白酶→高温中性蛋白酶→酸性蛋白酶三步酶解明胶，在组合酶的最佳工艺条件下，总水解率可达35.16％。
　　2.采用凝胶柱层析法对胶原多肽水解物的分子量分布进行测定，结果表明最优酶组合水解胶原多肽的分子量主要分布为1000 Da以下，占整个洗脱峰面积的74.4％，而且分子量为5000 Da以上的多肽只占5.22％。
　　3.通过对胶原多肽水解物清除DPPH·自由基和羟基自由基(·OH)的试验表明，该多肽清除DPPH·自由基及羟基自由基的作用随浓度的增大而增强，呈量效关系。胶原多肽浓度为12 mg/mL时，DPPH·自由基清除率达78.71％;浓度为40 mg/mL时，·OH清除率达89.12％，半清除浓度HSC5o为13.25 mg/mL。
　　4.通过D-半乳糖致小鼠衰老模型，研究胶原多肽水解物对氧化损伤模型小鼠的抗氧化作用。结果表明，胶原多肽可显著降低氧化损伤模型小鼠血清中MDA含量、肝脏中LF含量;显著增加血清和肝脏中GSH-Px活力;显著提高小鼠脾指数和胸腺指数(P＜0.05，P＜0.01)。
　　5.通过中波紫外线（UVB，280-320nm）和长波紫外线(UVA，320-400nm)诱发小鼠皮肤光老化模型，研究胶原多肽水解物对皮肤光老化小鼠的抗衰老作用。结果表明，胶原多肽可显著降低紫外线光致老化模型小鼠皮肤的MDA含量;显著增加HYP含量;显著降低紫外线光老化模型小鼠的皮肤重量(P＜0.05，P＜0.01)。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 胶原、明胶和胶原蛋白的特性

1．1．1 胶原、明胶和胶原蛋白的异同

1．1．2 胶原的结构及类型

1．1．3 胶原蛋白的应用概况

1．2 胶原活性多肽的研究进展

1．2．1 胶原多肽的一般性质

1．2．2 胶原多肽的制备工艺

1．2．3 胶原多肽的保健功能

1．3 本论文研究意义和主要内容

1．3．1 研究意义

1．3．2 研究内容

第二章 低分子胶原多肽制备工艺的研究

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 明胶成分的测定

2．2．2 明胶等电点的测定

2．2．3 蛋白酶活力测定

2．2．4 多肽得率的测定

2．2．5 水解度的测定

2．2．6 凝胶层析法测定分子量

2．2．7 胶原多肽的氨基酸组成及含量分析

2．2．8 明胶的酶解工艺路线与方案

2．3 结果与讨论

2．3．1 明胶的营养成分

2．3．2 明胶的等电点

2，3．3 明胶水解用酶的确定

2．3．4 2709碱性蛋白酶最佳水解条件的研究

2．3．5 中性蛋白酶最佳水解条件的研究

2．3．6 酸性蛋白酶三次酶解最佳条件的确定

2．3．7 胶原多肽的分子量分布

2．3．8 胶原多肽的氨基酸组成及含量

2．4 本章小结

第三章 胶原多肽的抗氧化作用研究

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2．体外抗氧化研究

3．2．1 DPPH·分析方法

3．2．2 羟自由基(·OH)清除能力的测定

3．2．3 DPPH·半清除浓度的计算和清除自由基能力的评价方法

3．3 体内抗氧化研究

3．3．1 实验动物的分组及造型

3．3．2 脏器指数的计算

3．3．3 肝组织蛋白含量的测定

3．3．4 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定

3．3．5 丙二醛(MDA)含量测定

3．3．6 肝脏中脂褐质(LF)含量测定

3．3．7 统计分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 胶原多肽清除DPPH·自由基的能力

3．4．2 胶原多肽清除羟自由基(·OH)的能力

3．4．3 小鼠衰老状况的分析

3．4．4 小鼠体重变化分析

3．4．5 胶原多肽对小鼠脏器指数的影响

3．4．6 胶原多肽对血清和肝脏MDA含量的影响

3．4．7 胶原多肽对血清和肝脏GSH-Px活性的影响

3．4．8 胶原多肽对肝脏LF含量的影响

3．5 本章小结

第四章 低分子量胶原多肽的美容抗皱作用研究

4．1 实验材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 透皮吸收机理

4．2．2 胶原多肽护肤品的配方及制备工艺

4．2．3 动物分组和饲养

4．2．4 小鼠皮肤光老化模型的建立

4．2．5 小鼠皮肤涂抹给药

4．2．6 皮肤组织匀浆中丙二醛(MDA)含量的测定

4．2．7 皮肤组织中羟脯氨酸(HYP)含量的测定

4．2．8 皮肤组织重量变化的测定

4．2．9 统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 小鼠皮肤衰老状况的观察分析

4．3．2 胶原多肽对皮肤组织中丙二醛(MDA)含量的影响

4．3．3 胶原多肽对皮肤组织中羟脯氨酸(HYP)含量的影响

4．3．4 胶原多肽对皮肤组织重量变化的影响

4．4 本章小结

参考文献

致谢

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