普鲁兰短梗霉HN2-3脂肪酶的生产、分离纯化、基因克隆和表达的研究

摘要

从盐场分离到一株高产脂肪酶的酵母菌HN2-3，经酵母常规鉴定方法和分子生物学方法鉴定为普鲁兰短梗霉。该酵母生产脂肪酶最佳培养基组分为3.0％(w/v)橄榄油、0.4％(w/v)葡萄糖、0.6％(w/v)硫酸铵、0.1％(w/v)K2HPO4和0.05％(w/v)MgSO4.7H2O，最佳培养条件为初始pH 7.0、培养温度25℃和转速170rpm。我们发现橄榄油的添加时间对于脂肪酶的生产具有很大的影响，在接种培养6h后加入橄榄油，继续培养96h，脂肪酶产量达到最大，酶活力达到8.0 U/ml。 普鲁兰短梗霉HN2-3胞外脂肪酶通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析得到纯化，纯化倍数为3.4。SDS-PAGE显示该脂肪酶分子量约为63.5 kDa。纯化酶的最适作用pH和最适作用温度分别为8.5和35℃，该酶被Hg2+ Fe2+和Zn2+强烈抑制。同时苯甲基磺酰氟可以强烈抑制该脂肪酶的活性。乙二胺四乙酸对该纯化酶的影响不大，碘乙酸可以微弱抑制该酶的活性。纯化的脂肪酶对于花生油具有较强的水解活性。 利用RACE的方法克隆了普鲁兰短梗霉HN2-3胞外脂肪酶的基因。该基因含有一个1245bp的ORF框，同时发现从基因组克隆得到的脂肪酶基因序列中含有一个55bp的内含子。该基因编码一个414个氨基酸残基的蛋白质，在氨基端含有一个26个氨基酸残基的信号肽。推导氨基酸序列含有脂肪酶的保守序列(G-X-S-X-G)和3个推测的N-糖基化位点。通过脂肪酶系统进化树分析，普鲁，兰短梗霉HN2-3脂肪酶与Aspergillus fumigatus(XP_750543)和Neosartorya fischeri(XP 001257768)脂肪酶亲缘关系最近，同源性分别为50％和51％。 将脂肪酶基因克隆到pET-24a(+)表达载体上，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE和免疫印迹分析发现重组蛋白的分子量约为47kDa。测定了阳性克隆BL21(DE3)/pET-24a(+)LIP1细胞裂解液的脂肪酶活力，达到0.96U/mg。重组脂肪酶最适作用pH和最适作用温度分别为8.0和35℃，重组脂肪酶依然对花生油具有较高的水解活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1脂肪酶简介

1.1脂肪酶的结构与催化机理

1.2微生物脂肪酶的水解特异性

1.3脂肪酶活力的测定

2微生物脂肪酶的生产

2.1产脂肪酶微生物的分离

2.2脂肪酶的发酵生产

3脂肪酶的分离纯化及性质研究

3.1假丝酵母脂肪酶

3.2地丝菌脂肪酶

3.3丝孢酵母脂肪酶

4微生物脂肪酶分子生物学的研究

4.1脂肪酶基因的克隆方法

4.2细菌脂肪酶

4.3真菌脂肪酶

5微生物脂肪酶的应用

5.1脂肪水解

5.2皮革生产

5.3纸浆和造纸

5.4加酶洗涤剂

5.5食品成分

5.6医学应用

5.7合成手性化合物

5.8油脂改性

5.9药物和化妆品

6本论文的研究目的与意义

7本论文研究和讨论的主要内容

第二章A.pullulans HN2-3脂肪酶生产条件的优化

1引言

2材料和方法

3结果与讨论

4本章小结

第三章A.pullulans HN2-3脂肪酶的分离纯化及性质研究

1引言

2材料和方法

2.1菌株

2.2培养基和试剂

2.3方法

3结果与讨论

3.1脂肪酶的分离纯化

3.2纯化脂肪酶的性质研究

4本章小结

第四章A.pullulans HN2-3脂肪酶基因的克隆

1引言

2材料和方法

2.1菌株与质粒

2.2培养基和试剂

2.3方法

3结果和讨论

3.1脂肪酶部分cDNA基因的克隆

3.2 RACE

3.3从基因组DNA扩增脂肪酶基因

3.4A.pullulans HN2-3脂肪酶基因LIP1序列分析

3.5A.pullulans HN2-3脂肪酶推导氨基酸序列(LIP1)分析

4本章小结

第五章A.pullulans HN2-3脂肪酶基因cDNALIP1在大肠杆菌中的表达

1引言

2材料和方法

2.1材料

2.2培养基和试剂

2.3方法

3结果与讨论

3.1 pET-24a(+)LIP1表达载体的构建

3.2 pET-24a(+)LIP1在大肠杆菌中的诱导表达

3.3重组脂肪酶的性质

4本章小结

参考文献

总结与创新点

攻读博士期间发表论文

致谢