普鲁兰短梗霉HN2-3菌株碱性蛋白酶的纯化、基因克隆、表达、表面展示及生产活性肽的应用研究

摘要

从分离自海水、海泥及海洋生物内脏及海生植物表面的400余株酵母菌中分离到5株产蛋白酶的海洋酵母，能在酪蛋白双层平板上形成明显的透明圈，它们分别是HN2-3，N13d，N13C，Mb5和HN3-2。通过酵母鉴定的常规方法并结合分子生物学方法，鉴定出HN2-3，N13d，N13C与HN3-24株菌属于普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)，Mb5菌株属于解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)。来自菌株HN2-3所产蛋白酶酶活性及酶解活性肽产物的ACE(AngiotensinI-converting enzyme)抑制活性最高。来自菌株HN2-3的蛋白酶命名为ALP2。 利用层析柱Sephadex G-75与阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化了菌株HN2-3的胞外碱性蛋白酶ALP2，纯化2.34倍。通过SDS-PAGE凝胶电泳，得到的ALP2蛋白条带分子量为33.0kDa，最适作用温度为52℃。Mn2+、Mg2+和Na+离子浓度在5 mM时对纯化蛋白酶酶活有激活作用， Zn2+、Ca2+、K+和Li+对酶活的影响不大；而当存在Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ag+、和Hg2+离子时，蛋白酶活明显降低。苯甲基磺酰氟(PMSF)强烈抑制蛋白ALP2的活性，乙二胺四乙酸(EDTA)与碘乙酸微弱抑制蛋白酶的活性。利用纯化的酶酶解砺虾蛋白，螺旋藻蛋白(Arthospira platensis)，酵母N3C(Yarrowia liolytica)和YA03a(Hansenia sporauvarum)蛋白，来自蛎虾蛋白的水解物ACE抑制活性与抗氧化活性最高，分别达到88.3％与47.3％。这说明纯化的ALP2蛋白酶在食品和医药方面具有良好的前景。 利用简并PCR、反向PCR与RT-PCR获得了蛋白酶ALP2基因的DNA序列与eDNA序列。基因ALP2的DNA序列为1354 bD，在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的登陆号为EU331441。ALP2基因的开放阅读框(ORF)1248 bp，在NCBI上的登陆号为EU224431，编码415个氨基酸，推导分子量为42.9 kDa。基因ALP2具有两个内含子，分别为54bp和52 bp。通过分子生物学软件分析，基因ALP2前18个氨基酸为信号肽序列，此基因编码的蛋白具有丝氨酸活性位点与组氨酸活性位点，等电点为6.44。利用质粒pINAl317对基因进行表达验证，发现转化子能在牛奶-PPB双层平板上形成明显的透明圈。转化子的发酵上清液的蛋白酶活性也进行了检测，结果说明克隆到的基因ALP2确实为蛋白酶基因，而且能在Y.lipolytica中进行表达，并分泌到细胞外。利用本实验室构建的表面展示质粒pINA1317-YICPW110对蛋白酶基因ALP2进行了表面展示，转化子能在牛奶双层平板上形成明显的透明圈。表面展示的蛋白酶酶解不同的蛋白源能够产生活性肽，发现酶解金黄色隐球酵母G7a(Cryptococcus aureus)的细胞蛋白所产活性肽的ACE抑制活性最高，酶解螺旋藻蛋白所产活性肽的抗氧化活性最高。这是首次关于利用表面展示蛋白酶进行活性肽的生产的报道。 将表面展示的蛋白酶进行了酶学特性研究，发现与菌株HN2-3所产的野生型蛋白酶相比，最适作用温度有所降低，温度稳定性增强；另外发现表面展示的蛋白酶对金属离子的亲和力降低。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪言

前言

第一节蛋白酶的研究进展

第二节生物活性肽的研究进展

第三节表面展示技术的研究进展

第四节海洋酵母的研究进展及本研究的目的与意义

第二章产蛋白酶海洋酵母的筛选

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与讨论

3.1产蛋白酶海洋酵母的筛选

3.2 5株海洋酵母的鉴定

3.3酶解蛎虾蛋白所产活性肽的ACE抑制活力测定

4本章小结

第三章A.pullulansHN2-3蛋白酶的分离纯化、特性研究及酶解不同蛋白源产活性肽的研究

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与讨论

3.1蛋白酶发酵液浓缩及SephadexTM G-75凝胶层析部分纯化

3.2 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化化

3.3不连续SDS-PAGE凝胶电泳

3.4纯化蛋白酶最适作用温度与温度稳定性

3.5纯化蛋白酶最适作用pH与pH稳定性

3.6金属离子对蛋白酶ALP2酶活的影响

3.7蛋白抑制剂对纯化蛋白酶ALP2酶活的影响

3.8蛋白水解产物ACE抑制活性和抗氧化活性

4本章小结

第四章A.pullulansHN2-3蛋白酶基因克隆与信息学分析

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与讨论

3.1简并PCR引物的设计

3.2简并PCR克隆碱性蛋白酶ALP2部分基因

3.3反向PCR获得碱性蛋白酶ALP2全部基因

3.4碱性蛋白酶基因ALP2生物信息学分析

4本章小结

第五章普鲁兰短梗霉HN2-3蛋白酶基因APL2的表达

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与讨论

3.1受体菌的选择

3.2 PMD19-T simple-ALP2重组质粒构建

3.3连接表达载体的阳性克隆的检测

3.4含蛋白酶基因的质粒片断转化Y.lipolytica Polh

3.5转化子蛋白酶活力的测定

4本章小结

第六章A.pullulansHN2-3蛋白酶ALP2的表面展示及表面展示蛋白酶的特性研究

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与讨论

3.1蛋白酶ALP2表面展示质粒构建

3.2 PMD19-T Vector simple-ALP2重组质粒的构建

3.3重组质粒pINA1317-YICPW110-ALP2的构建

3.4含蛋白酶基因的质粒片断转化Y.lipolytica Polh

3.5免疫荧光反应

3.6转化子蛋白酶活力的测定

3.7具6×His标签的表面展示蛋白的特性研究

4本章小结

第七章表面展示蛋白酶ALP2酶解不同蛋白源产活性肽的研究初步

1前言

2材料和方法

2.1材料

2..2方法

3结果与讨论

3.1蛋白水解产物抑制ACE活性与抗氧化活性

3.2表面展示蛋白酶使用周期的测定

4本章小结

参考文献

总结与创新点

发表的学术论文

附表1 缩写符号及其中英文名称

致谢