食品中桔霉素快速检测方法的研究

摘要

背景：桔霉素又称桔青霉素,在红曲产品中的含量较多,红曲在我国应用有近千年历史,很早就广泛用作食品防腐剂、增香剂、发酵剂,酿酒以及制备红曲和各种传统食品.桔霉素是一种真菌产生的次级代谢产物,具有较明显的肾毒性,对实验动物可致畸,剂量过大会导致动物死亡.目前,最常用的桔霉素检测方法主要为酶联免疫吸附分析方法、高效液相色谱法和高效毛细管电泳法等,上述检测方法均需要复杂的样品前处理步骤,不仅复杂,耗时长,且难以进行痕量检测.采用免疫亲和层析方法直接对样品中的桔霉素进行富集净化,不仅可同时制备、萃取和净化样品,且免疫亲和柱具有较好的特异性,重现性好,能快速从样品中分离纯化出桔霉素.本研究采用自制的免疫亲和柱萃取样品中的桔霉素,采用具有高效分离能力的高效毛细管电泳法进行分离检测,建立的快速检测方法可用于多种食品中桔霉素的常规检测与监管.
　　目的：采用合成桔霉素免疫原免疫动物,获得抗桔霉素抗体.采用本体聚合的方法,优化条件制备嵌合铜离子(CuII)聚合物作为免疫亲和柱填料,将所得抗体偶联于聚合物填料制备免疫亲和柱,并对两种红曲产品中的桔霉素进行富集净化,同时用高效毛细管电泳的方法进行分离检测,建立了食品中桔霉素的快速检测方法.
　　方法：合成桔霉素免疫原,并对其结构进行鉴定,采用合成的免疫原免疫大白兔制备抗桔霉素多克隆抗体.采用间接非竞争酶联免疫吸附分析方法测定抗血清效价,并进一步采用高效毛细管电泳方法验证抗血清中含有抗桔霉素的特异性抗体.制备嵌合铜离子聚合物填料,以丙烯酰胺作为功能单体,以二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)作为交联剂,采用本体聚合的方法合成嵌合铜离子聚合物.利用CuII对蛋白质分子的螯合力,将抗桔霉素多克隆抗体吸附到嵌合铜离子聚合物的固定相上.然后将吸附了抗体的固定相装入固相萃取柱里制备免疫亲和柱,对洗脱条件进行了优化.在此条件下,测定了免疫亲和柱吸附容量、添加回收率等性能指标.最后,用高效毛细管电泳的方法检测样品中的桔霉素,选择pH为9.28的20 mmol/L的硼砂缓冲液,运行电压为20 kV,紫外检测波长为319 nm,毛细管柱温为25℃.毛细管的有效长度为45 cm,毛细管的内径为75μm,对其分离分析条件进行了进一步优化.
　　结果：对合成针对桔霉素抗原中载体蛋白与桔霉素的物质的量之比进行紫外测定,桔霉素与BSA物质的量之比是26.38:1,桔霉素与OVA的物质的量之比是17.58:1.采用桔霉素和BSA的偶联物为免疫原免疫大白兔,分析了抗体的产生进程与效价.1号和2号大白兔分别从第35天和第49天开始有明显抗体产生,约在第77天抗体含量达到最高峰,3号大白兔一直没有较明显的抗体产生.1号、2号和3号大白兔的抗血清效价分别是:1:135000、1:16000和1:4000.优化选择了制备嵌合铜离子聚合物的合成条件,在水溶液环境下,选择的醋酸铜含量是30 mg,聚合物吸附抗体时间为10 h,测得聚合物对抗体的最大吸附量是196 mg/g,选用pH为7,浓度为60％的甲醇,抗体能够较好地吸附到CuII聚合物上.采用高效毛细管电泳方法测定红曲产品中的桔霉素,通过研究洗脱液的种类、浓度和pH等因素对分离结果的影响,选用80％的甲醇溶液作为提取剂,采用PBS缓冲液洗涤,60％的甲醇溶液洗脱,可以将免疫亲和柱中结合的桔霉素完全洗脱下来,并且不会影响CuII聚合物上所连抗体的稳定性。测得免疫亲和柱对桔霉素的最大吸附能力约为597 ng,通过实验检测,在50～150μg/kg浓度范围内,红曲红和红曲米中样品桔霉素回收率为83.7％～93.2％,相对标准偏差为0.84％～2.06％.
　　结论：本研究通过合成桔霉素免疫原,制备抗桔霉素多克隆抗体,采用自制的免疫亲和柱净化样品中的桔霉素,最后采用高效毛细管电泳法对样品进行分离检测,建立了发酵食品中桔霉素的免疫亲和柱富集净化技术和高效毛细管电泳分离检测方法.

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中英文名词术语对照

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第一章 文献综述

1 本课题的选题依据

2 生物毒素的残留现状及危害

3 桔霉素概述

4 免疫亲和色谱法概述

5 毛细管电泳技术概述

第二章 桔霉素免疫原及抗体的制备与表征

1 材料与设备

2 试验方法

3 实验结果与讨论

4 小结

第三章 CuII聚合物的制备与表征

1 材料与设备

2 试验方法

3 实验结果与讨论

4 小结

第四章 免疫亲和柱的制备及其在发酵食品中桔霉素检测方面的应用

1 材料与设备

2 试验方法

3 实验结果与讨论

4 小结

实验结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表文章