ε-聚赖氨酸、Nisin和纳他霉素的抑菌特性及协同抑菌机理研究

摘要

随着经济社会的发展，人们对绿色食品、健康食品越来越重视，食品保藏中常添加抑菌剂，其中化学抑菌剂对人体存在潜在的危害，因此安全低毒的天然抑菌剂需求量不断增大。天然抑菌剂复配不仅可以减少单种抑菌剂的添加量，降低成本，而且可以弥补单种抑菌剂的不足，扩大抑菌谱。因此，复配天然抑菌剂的研发具有重要的实践意义。
　　本文分析了ε-聚赖氨酸、nisin和纳他霉素单独使用和联用后的抑菌效果，筛选出具有协同抑菌效果的组合。研究了ε-聚赖氨酸和nisin联用对枯草芽孢杆菌的协同抑菌机理，研究结果如下:
　　1.通过测定抑菌圈直径和最小抑菌浓度发现:ε-聚赖氨酸、nisin、纳他霉素三种生物抑菌剂对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、汉逊酵母、黑曲霉和扩展青霉均表现出一定的抑制能力;通过测定FICI值发现:ε-聚赖氨酸、nisin、纳他霉素两两联用对七种供试菌中的某些菌株表现出一定的协同效果，ε-聚赖氨酸与nisin联用后对四种供试细菌均表现出明显的协同效果。
　　2.以枯草芽孢杆菌为例，研究了ε-聚赖氨酸、nisin以及它们联用组的抑菌活性与作用时间的关系，发现ε-聚赖氨酸的活性随作用时间呈上升趋势，在20h左右达到活性峰;nisin在作用3h左右达到活性峰，6h后活性呈下降趋势，ε-聚赖氨酸与nisin联用组在3h左右出现活性峰，随后下降，而在9h后活性逐渐恢复，与ε-聚赖氨酸的活性相同，由此推测两种抑菌剂联用时第一次活性峰的出现与nisin关系密切，而后一次活性峰的出现主要是由于ε-聚赖氨酸的作用。
　　3.通过测定不同的抑菌剂处理之后菌体溶液在630nm处的吸光值，观察扫描电镜以及透射电镜，发现ε-聚赖氨酸对细胞壁的破坏程度较小，而经nisin处理后的细胞壁严重被破坏，失去立体感，只能看出细胞的轮廓。经ε-聚赖氨酸与nisin共同处理后，菌体细胞坍塌，细胞轮廓模糊，细胞壁的破坏程度强于单独使用。
　　4.测定了ε-聚赖氨酸与nisin单独使用和联用后溶液的相对电导率，蛋白质的渗漏量，紫外吸收物质泄漏情况以及ATP酶的活力，结果显示ε-聚赖氨酸处理组、nisin处理组、联用处理组的相对电导率、蛋白质的渗漏量，紫外吸收物质泄漏量依次增大，说明联用组极大的增强了细胞膜的通透性。PI标记后nisin处理组和联用组的荧光强度增大，同样说明了nisin处理组和联用组能够破坏细胞膜，增大细胞膜的通透性;不同的抑菌剂处理后细胞Na+K+-ATP酶活力，Ca++Mg++-ATP酶活力较对照都明显的下降，且差异性显著。
　　5.DNA琼脂糖凝胶电泳实验显示nisin和联用组处理的菌体DNA断裂，大量降解;紫外光谱法检测与DNA的相互作用发现ε-聚赖氨酸处理组的吸收峰红移，峰值值明显减少，出现减色效应，推测ε-聚赖氨酸可能嵌插入DNA中，而nisin处理组与对照组差异不显著;通过荧光光谱分析其与DNA相互作用发现，ε-聚赖氨酸与DNA发生了结合作用，nisin与DNA之间基本无结合作用，综上说明，nisin处理组DNA的断裂是在细菌死亡后菌体DNA在细胞外的自行裂解，ε-聚赖氨酸与DNA有较强的结合作用。
　　6.磷酸盐的加入减弱了ε-聚赖氨酸对EB-DNA的淬灭作用，表明ε-聚赖氨酸可能与DNA上的磷酸基团发生了结合作用;ε-聚赖氨酸加入EB-DNA的复合体系，荧光强度减弱，说明ε-聚赖氨酸与EB竞争结合DNA;在ε-聚赖氨酸-DNA复合体系中加入EB，随着EB浓度的增大，荧光强度增大，由此也说明了ε-聚赖氨酸与EB竞争结合DNA。
　　由此推测，ε-聚赖氨酸与nisin协同抑菌机理可能为:nisin首先破坏细胞壁细胞膜，ε-聚赖氨酸进入胞内与DNA发生结合，阻碍了DNA进行复制，同时它们抑制了细胞膜上的ATP酶活力，达到协同抑菌的效果。

目录

声明

符号和缩略词说明

摘要

1 前言

1．1 天然抑茵剂研究概述

1．1．1 天然抑菌剂抑菌作用

1．1．2 ε-聚赖氨酸，乳酸链球菌素，纳他霉素抑菌研究综述

1．2 天然抑菌剂抑菌机制研究概述

1．2．1 ε-聚赖氨酸抑菌机制

1．2．2 乳酸链球菌素抑菌机制

1．2．3 纳他霉素抑菌机制

1．3 本项研究的目的意义及研究内容

1．3．1 研究的目的意义

1．3．2 主要研究内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 主要试剂及配制

2．2．1 主要试剂药品

2．2．2 相关试剂的配制

2．3 主要仪器设备

2．4 技术路线

2．5 实验方法

2．5．1 抑菌圈直径的测定

2．5．2 最小抑菌浓度(MIC)的测定

2．5．3 体外联合抑菌能力的判定

2．5．4 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定

2．5．5 枯草芽孢杆菌的抑菌动力学

2．5．6 对枯草芽孢杆菌细胞壁的影响

2．5．7 对枯草芽孢杆菌细胞膜的影响

2．5．8 抑菌剂与枯草芽孢杆菌DNA的相互作用

2．6 统计分析

3 结果与分析

3．1 抑菌圈直径测定

3．2 MIC的测定及联合抑菌能力的判定结果

3．2 枯草芽孢杆菌的生长曲线

3．4 枯草芽孢杆菌的抑菌动力学

3．5 对枯草芽孢杆菌细胞壁的影响

3．5．1 对枯草芽孢杆菌细胞壁作用的检测

3．5．2 对枯草芽孢杆菌的扫描电镜观察

3．5．3 对枯草芽孢杆菌的透射电镜观察

3．6 对枯草芽孢杆菌细胞膜的影响

3．6．1 对枯草芽孢杆菌细胞膜通透性的影响

3．6．2 对枯草芽孢杆菌蛋白质的渗漏的影响

3．6．3 对枯草芽孢杆菌紫外吸收物质泄露的影响

3．6．4 对枯草芽孢杆菌PI标记后的荧光光谱

3．6．5 对枯草芽孢杆菌细胞膜ATP酶活力的影响

3．7 抑菌剂与枯草芽孢杆菌DNA的相互作用

3．7．1 DNA的琼脂糖凝胶电泳

3．7．2 抑菌剂与DNA结合的紫外图谱

3．7．3 抑菌剂与细菌DNA结合的荧光光谱

3．7．4 磷酸根离子对ε-聚赖氨酸与DNA结合的影响

3．7．5 ε-PL对EB-DNA复合体系滴定的荧光光谱

3．7．6 EB对复合体系ε-聚赖氨酸-DNA滴定的荧光光谱

4 讨论

4．1 生物抑菌剂单独使用及复配抑菌效果的分析

4．2 抑菌剂单独使用及复配抑菌机理的分析

5 结论

参考文献

致谢

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