秀丽线虫细胞色素b5及其还原酶调控多不饱和脂肪酸的合成

摘要

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是许多细胞及生理活动中非常重要的成分，机体多不饱和脂肪酸的平衡影响着生物体正常的生理功能。哺乳动物体内合成多不饱和脂肪酸实际上是一个耗氧的过程，饱和脂肪酸在一系列酶诸如细胞色素b5、黄素蛋白-NADH-依赖型细胞色素b5还原酶(Ncb5or)和脂肪酸去饱和酶等蛋白的共同作用下形成多不饱和脂肪酸。已有研究表明在小鼠、利什曼原虫和拟南芥中，特定的脂肪酸合成缺陷与细胞色素b5还原酶或者与细胞色素b5相关，但对NADH-细胞色素b5还原酶、细胞色素b5、硬脂酰辅酶A去饱和酶以及其他的去饱和酶之间的相互关系还未曾报道。在秀丽线虫多不饱和脂肪酸合成过程中NADH-细胞色素b5还原酶和细胞色素b5是以哪种形式的存在并发挥着作用还不清楚，也不知道秀丽线虫中从FAT-1～FAT-7的脂肪酸去饱和酶在去饱和作用过程中是否需要NADH-细胞色素b5还原酶和细胞色素b5的共同参与来激活并发挥功能？
　　本研究以秀丽线虫作为模式生物，通过分子生物学和遗传学方法探索属于P450酶系超家族基因的NADH-细胞色素b5还原酶和细胞色素b5影响多不饱和脂肪酸合成的具体机制。运用RNA干扰抑制基因表达的方法来抑制NADH-细胞色素b5还原酶和细胞色素b5的基因，并将提取的脂肪酸采用气相色谱来检测脂肪酸成分的变化。利用薄层色谱-气相色谱连用的方法检测秀丽线虫脂肪含量的变化。本研究还运用荧光实时定量PCR检测秀丽线虫相关脂肪酸合成与分解关键基因的表达量及用基因过表达绿色荧光蛋白的荧光强度检测蛋白表达水平。并利用外源添加所缺脂肪酸的方法来缓解其缺陷的表型。
　　在本研究中，寻找到NADH-依赖型细胞色素b5还原酶和细胞色素b5，以及他们在秀丽线虫不同的去饱和酶活性功能发挥过程中所起的作用。本研究发现线虫中NADH-细胞色素b5还原酶的同源基因为T05H4.4、hpo-19;细胞色素b5的同源基因为cytb-5.1。三个基因功能缺失后，线虫脂肪酸成分发生显著的变化。hpo-19和cytb-5.1干扰株脂滴变小、产卵减少、多不饱和脂肪酸含量和脂肪储存量减少。另外，抑制hpo-19导致生长发育变缓，抑制cytb-5.1导致寿命缩短等多种表型。在脂肪酸去饱和酶基因表达的研究过程中，hpo-19和cytb-5.1明显使fat-2、fat-6和fat-7上调。外源补充所缺脂肪酸缓解其缺陷发现当hpo-19添加C18∶3n3、C18∶3n6和C20∶4n6时，其下游产物都可以部分恢复，但添加C20∶3n6时，其下游产物C20∶4n6没有任何恢复。而cytb-5.1外源加入C18∶1n9、C18∶2n6、C18∶3n3、C18∶3n6、C20∶3n6和C20∶4n6等六种脂肪酸时，都能将其下游产物的脂肪酸和生长表型等恢复。细胞色素b5(CYTB5.1)主要与硬脂酰辅酶A去饱和酶(FAT-6、FAT-7)共同作用调控脂肪酸合成，而细胞色素b5还原酶(HPO-19)与FAT-1、FAT-2、FAT-3和FAT-4共同作用，主要与FAT-2和FAT-4共同作用调节秀丽线虫多不饱和脂肪酸的合成。

目录

摘要

第一章 前言

1 多不饱和脂肪酸的研究进展

1．1 脂肪

1．2 脂肪酸的分类

1．3 多不饱和脂肪酸分类及来源

1．4 多不饱和脂肪酸的功能

1．5 秀丽线虫多不饱和脂肪酸的合成

2 细胞色素b5及其还原酶研究进展

2．1 细胞色素P450

2．2 细胞色素b5及还原酶

2．3 细胞色素b5及还原酶在多不饱和脂肪酸形成过程中的作用

3 硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)研究进展

4 秀丽线虫作为模式生物的优势

4．1 秀丽线虫生物学特征

4．2 秀丽线虫作为脂类代谢模式生物的优势

5 脂滴的概述

6 本课题研究意义

第二章 hpo-19、T05H4．4和cytb5．1功能缺陷对秀丽线虫脂肪酸成分的影响

1 材料、试剂、仪器和方法

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 溶液配制

1．5 实验方法

1．5．1 秀丽线虫的培养

1．5．2 气相色谱法检测秀丽线虫脂肪酸成分的变化

1．6 统计分析方法

2 结果与分析

2．1 脂肪酸成分及含量

3 本章小结

第三章 hpo-19、T05H4．4和cytb5．1对PUFAs合成相关基因与蛋白表达的影响

1 材料、试剂、仪器和方法

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 溶液配制

1．5 实验方法

1．6 统计分析方法

2 结果与分析

2．1 RNA干扰效果的检测

2．2 脂肪酸合成相关基因表达量检测

2．3 脂肪酸去饱和酶蛋白表达量检测

3 本章小结

第四章 外源脂肪酸对线虫PUFAs合成缺陷的恢复作用

1 材料、试剂、仪器和方法

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 溶液配制

1．5 实验方法

1．6 统计分析方法

2 结果与分析

2．1 秀丽线虫的食物(E．coli)对外援脂肪酸的吸收

2．2 外源脂肪酸对秀丽线虫PUFAs合成缺陷的缓解作用

3 本章小结

第五章 hpo-19、T05H4．4和cytb5．1功能缺失对线虫脂肪含量、生长发育、生殖能力等表型的影响

1 材料、试剂、仪器和方法

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 溶液配制

1．5 实验方法

1．6 统计分析方法

2 结果与分析

2．1 T05H4．4、hpo-19和cytb5．1功能缺失后对脂滴的影响

2．2 T05H4．4、hpo-19和cytb5．1功能缺失后对脂肪含量的影响

2．3 T05H4．4、hpo-19和cytb5．1功能缺失后对生长发育的影响

3 本章小结

讨论与结论

参考文献

附表

致谢

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