蛹虫草培养基中多糖的分离纯化及其乙酰酯糖的生物活性研究

摘要

本研究选择蛹虫草固体培养基为原料，采用超声波-酶法对蛹虫草培养基多糖的提取工艺进行优化。并对得到的蛹虫草基质粗多糖进行分离纯化，系统的研究了乙酰化的蛹虫草培养基多糖的功能性。 1.采用超声波-酶法提取蛹虫草培养基多糖，利用Box-Benhnken中心组合试验及响应面(RSM)设计优化蛹虫草多糖的提取工艺，在单因素实验的基础上，建立了纤维素酶用量、酶解时间、超声时间、超声温度的四因素回归模型。确定了蛹虫草培养基多糖的最佳提取工艺为纤维素酶用量1.9％，酶解处理1.1h，在50℃下超声处理41min。在最佳条件下，蛹虫草多糖得率为25.45％，和传统的提取方法相比，多糖的得率有了很大的提高。 2.以蛋白清除率和多糖保留率为指标，分别比较sevag法、TCA法、活性炭法以及酶法清除蛹虫草培养基多糖的效果，通过比较选出最有效的除蛋白方法;并进一步将除蛋白的多糖经DEAE-cellulose52柱层析分离得到纯化的蛹虫草培养基多糖（CMRP-1），采用紫外光谱法以及SephadexG-100凝胶柱层析鉴定其纯度，结果表明:sevag法的除蛋白效果最好，CMRP-1是均一的多糖。 3.以甲酰胺为溶剂，乙酸酐为酰化剂，DMF为催化剂，对CMRP-1进行化学修饰;并测定修饰化前后CMRP-1清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力。结果显示，乙酰化CMRP-1的取代度为0.468，并且经红外光谱表征证明多糖已成功乙酰化，且乙酰化衍生物的抗氧化活性高于CMRP-1，且接近于抗坏血酸。 4.进一步研究了乙酰化CMRP-1对酒精所致小鼠急性肝损伤的保护作用，采用50％酒精诱导小鼠急性肝损伤，小鼠脱臼处死后取血液测定血浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力、甘油三酯(TG)含量、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性，取肝脏、脾脏和胸腺计算其系数，并制备肝匀浆测定其中超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量，对数据作统计学分析。结果显示:150(mg/kg)乙酰化CMRP-1组的脾脏指数、血浆中SOD活力、TG含量、ALT、AST活性以及肝组织中SOD活力、GSH-PX活力、MDA、GSH含量与模型组各水平相比均具有显著性差异(P＜0.05);与空白组相比，150(mg/kg)乙酰化CMRP-1组的各项指标都接近于正常水平;且150(mg/kg)乙酰化CMRP-1组的脾脏指数、血浆中ALT、AST活性以及肝组织中SOD活力、GSH-PX活力、GSH含量都明显优于阳性对照组;另外，300(mg/kg)乙酰化CMRP-1组和600(mg/kg)乙酰化CMRP-1组对酒精性肝损伤小鼠并没有起到保护作用，猜测与乙酰化CMRP-1的剂量有关。结果表明，150(mg/kg)乙酰化CMRP-1对酒精诱导的小鼠急性肝损伤有明显的保护作用。

目录

声明

摘要

前言

第一章 综述

1．1 蛹虫草的研究进展

1．1．1 蛹虫草的主要活性成分

1．2 多糖的提取、分离及纯化

1．2．1 多糖的提取

1．2．2 多糖的分离纯化

1．3 多糖的分子修饰

1．3．1 多糖的乙酰化

1．3．2 多糖的磺酰化

1．3．3 多糖的烷基化

1．3．4 多糖的羧甲基化

1．4 虫草多糖的功能性研究进展

1．4．1 多糖的抗肿瘤活性研究

1．4．2 虫草多糖降血糖的作用

1．4．3 虫草多糖肝和肾的保护

1．4．4 虫草多糖的免疫调节作用

1．5 本论文研究的目的和意义

第二章 响应面法研究超声波-酶法提取蛹虫草培养基多糖的最佳工艺

2．1 材料和仪器

2．1．1 实验原料和试剂

2．1．2 仪器

2．1．3 实验方法

2．1．4 糖含量测定

2．1．5 单因素实验

2．1．6 响应面试验设计

2．2 结果与分析

2．2．1 单因素试验结果

2．2．2 响应面实验结果分析

2．3 结论

第三章 蛹虫草培养基中多糖的分离纯化及纯度鉴定

3．1 材料和仪器

3．1．1 实验原料和试剂

3．1．2 仪器

3．1．3 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 除蛋白

3．2．2 柱层析结果

3．2．3 纯度鉴定的结果

3．3 结论

第四章 CMRP-1的乙酰化修饰及其乙酰酯糖的生物活性研究

4．1 材料和仪器

4．1．1 实验原料和试剂

4．1．2 仪器

4．1．3 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 CMRP-1的乙酰化修饰结果

4．2．2 乙酰化前后CMRP-1的体外抗氧化活性研究

4．2．3 乙酰化CMRP-1对急性酒精肝损伤小鼠的作用

4．3 讨论

参考文献

附录

致谢