高产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株选育及其转化条件优化

摘要

γ-氨基丁酸(简称GABA),是哺乳动物中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质,具有许多重要的生理功能,其作为一种新型功能性因子正广泛应用于各个领域。
　　 本文首先通过筛选、诱变得到一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌菌株,然后通过摇瓶培养及转化条件和5 L发酵罐培养及转化条件的优化,进一步提高了其γ-氨基丁酸的产量。具体内容和结果如下:
　　 首先,从样品中筛选到一株高产GABA菌株01,对菌株01进行形态学和常规生理生化鉴定实验及16S rDNA基因序列分析,比对结果表明,菌株01与Lactobacillusplantarum strain EW-p的16S rDNA序列相似性最高,为99％,且与生理生化特征实验结果相一致,因此确定菌株01为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),将其命名为LP-GB01。以LP-GB01为出发菌株,经紫外诱变处理,以GABA梯度平板筛选到一株高产GABA的突变株LP-GB01-21。该诱变菌株以80 g/L的L.谷氨酸为底物进行全细胞转化,24 h后GABA含量达到51.9 g/L,与出发菌株相比产量提高了55.39％。该高产突变株LP-GB01-21已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M209102。
　　 其次,在摇瓶水平上考察了碳氮源、酵母粉及无机盐等培养条件对LP-GB01-21菌体生长和GABA产率的影响,确定种子培养基成分为:葡萄糖10 g/L,蛋白胨15 g/L、酵母粉10 g/L、丁二酸钠4 g/L、MgSO40.75 g/L、K2HPO43 g/L,、谷氨酸钠3 g/L;最适培养条件为:温度30℃,初始pH7.0,摇床转速250 r/min,菌龄36 h。与原始培养条件相比,优化培养条件下乳酸菌菌体量增长了25.15％,GABA产率达到了88.3％,是原始条件下的GABA产率的1.35倍。
　　 第三,对影响GABA转化条件进行了研究,确定最适转化温度35℃,缓冲液pH4.8,缓冲液浓度0.2 mol/L,摇床转速150 r/min。与原始培养转化条件相比,优化培养转化条件下的菌体量有所增加,转化相同时间时GABA产率达到94.73％,是原始条件下的产率的1.42倍。
　　 第四,在5 L发酵罐上考察了溶氧条件对LP-GB01-21菌株GABA转化的影响,结果表明,高溶氧条件有利于菌体生长,低溶氧条件有利于GABA生成。本论文还对GABA补料转化进行初步研究,以70 g/L的投料量投料3次,转化80 h时GABA浓度达到143.55g/L,产率为97.56％。同时发现转化体系pH对GABA转化影响较大,根据摇瓶实验确定缓冲液最适pH为4.8～5.0,因此在前面补料转化实验基础上控制转化体系pH为5进行实验,结果显示转化70 h时GABA产率即高达99.13％,说明控制转化体系pH可缩短转化时间,提高转化效率。
　　 本实验选育的菌株LP-GB01-21及其GABA生产工艺已申请国家发明专利,转让于山东某生产企业,目前已经完成吨级发酵罐中试,预期建成我国微生物合成法生产γ-氨基丁酸的产业化试验装置。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 γ-氨基丁酸简介

1.1.1 γ-氨基丁酸的结构及理化性质

1.1.2 生物体内γ-氨基丁酸的代谢途径

1.2 γ-氨基丁酸的生理作用及应用

1.2.1 γ-氨基丁酸的生理作用

1.2.2 γ-氨基丁酸的应用

1.3 γ-氨基丁酸合成方法

1.3.1 化学合成法

1.3.2 植物富集法

1.3.3 微生物合成法

1.4 国内外对γ-氨基丁酸的研究现状

1.4.1 国外研究状况

1.4.2 国内研究状况

1.5 诱变育种

1.5.1 诱变方法简介

1.5.2 紫外诱变作用机理

1.6 本论文的立题意义及主要研究内容

1.6.1 本论文的立题意义

1.6.2 本论文的主要研究内容

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 样品及菌种

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 培养基及缓冲液

2.2 实验方法

2.2.1 菌种筛选

2.2.2 GABA含量测定方法

2.2.3 菌株鉴定

2.2.4 诱变育种

2.2.5 菌种培养条件的建立与优化

2.2.6 菌种全细胞转化条件的建立与优化

2.2.7 5L发酵罐水平的菌种培养及转化条件的初步研究

第三章 结果与讨论

3.1 菌种筛选

3.1.1 菌种初筛结果

3.1.2 菌种复筛结果

3.2 菌种鉴定

3.2.1 菌株菌落特征及形态学鉴定

3.2.2 生理生化特征

3.2.3 菌株16S rDNA序列分析及分子鉴定

3.3 诱变育种

3.3.1 出发菌株的筛选及其生长曲线的测定

3.3.2 最佳诱变剂量的确定

3.3.3 诱变结果及遗传稳定性实验

3.4 菌种培养条件的建立与优化

3.4.1 碳源的选择及浓度的确定

3.4.2 氮源的选择及浓度的确定

3.4.3 酵母粉添加量的确定

3.4.4 无机盐的选择及浓度的确定

3.4.5 正交试验

3.4.6 培养温度对菌体生长及其转化效率的影响

3.4.7 培养基初始pH对菌体生长及其转化效率的影响

3.4.8 摇床转速对菌体生长及其转化效率的影响

3.4.9 培养时间对菌体生长及其转化效率的影响

3.4.10 在优化培养条件下摇瓶初步实验

3.5 菌种全细胞转化条件的建立与优化

3.5.1 反应温度对GABA转化的影响

3.5.2 缓冲液初始pH对GABA转化的影响

3.5.3 缓冲液浓度对GABA转化的影响

3.5.4 摇床转速对GABA转化的影响

3.5.5 在优化的培养转化条件下的摇瓶实验

3.6 5L发酵罐水平的培养及转化条件的初步研究

3.6.1 5L发酵罐水平的初步实验

3.6.2 溶氧对乳酸菌生长及GABA转化的影响

3.6.3 5L发酵罐批次流加转化实验

3.6.4 pH控制对发酵罐批次流加转化实验的影响

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表论文及申请专利