Bacillus cereus中羰基还原酶的基因挖掘及克隆表达研究

摘要

手性醇是工业合成药物、农用化学品、天然产品及某些特殊材料过程中一种重要的手性砌块。利用羰基还原酶不对称还原前手性羰基化合物，是合成手性醇的重要方法之一。本文通过构建基因挖掘策略，挖掘蛋白质数据库中潜在羰基还原酶，并进行了克隆表达研究。
　　本研究在确定羰基还原酶各家族的氨基酸保守序列后，选取来源于极端嗜热菌Aeropyrum pernix K1中的羰基还原酶(ApCR)，作为探针酶。以探针酶的氨基酸序列为模板，在蛋白质数据库中进行同源序列比对、筛选后，构建候选酶库。通过对候选酶序列和探针序列进行氨基酸序列比对、二级结构模拟比对、三级结构模拟比对后，确定来源于蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus中的蛋白BcCR，与探针ApCR序列具有相似的二级、三级结构，并且都具有羰基还原酶SDRs家族的氨基酸保守序列，推测该蛋白具有与ApCR相似的酶学性质及功能。以B.cereus的基因组DNA为模板，PCR克隆出BcCR基因(738bp)，构建重组质粒pET28a-BcCR，并将其导入在E.coli B121(DE3)plysS中，实现了可溶性表达，蛋白大小约为32kDa。
　　对表达出的目标酶进行酶学性质研究发现，其最适反应温度为57.5℃，最适反应pH为7.0，该酶在40℃范围内较稳定，未发现能明显促进该酶催化能力的金属离子。该酶对COBE的动力学参数Km=1.85mmol/L，最大反应速率Vmax=0.22μmol·min-1·mg-1。目标酶的这些酶学性质与基因挖掘过程中BcCR与ApCR的比对初步分析结果基本吻合。利用重组菌的全细胞，催化羰基化合物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)还原，进行羰基还原酶的功能性鉴定，还原产物通过气相色谱进行检测。当底物浓度为20mmol/L、菌体浓度为0.1g/mL时，37℃反应20h后，产率达到67.7％。羰基还原的产物旋光值α＞0，产物构型为(R)-CHBE。
　　本文构建了一种羰基还原酶的基因挖掘策略，利用该方法成功获得了一种来源于B.cereus的新型羰基还原酶BcCR，为获取高效羰基还原酶提供基础研究。与传统的获取羰基还原酶的方法相比，基因挖掘显得更高效，前景更广。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 羰基还原酶研究进展

1．1．1 羰基还原酶催化机制

1．1．2 羰基还原酶来源及发现

1．1．3 获取高效羰基还原酶途径

1．2 基因挖掘研究现状

1．3 基因挖掘获取羰基还原酶研究进展

1．3．1 基因组狩猎法

1．3．2 数据库挖掘法

1．4 手性醇应用及合成

1．4．1 化学合成法

1．4．2 手性拆分法

1．4．3 不对称还原法

1．5 本课题研究内容

2．1 引言

2．2 方法

2．2．1 数据库挖掘策略构建

2．2．2 基因挖掘原理

2．2．3 基于UniProt的羰基还原酶基因挖掘

2．3 结果与讨论

2．3．1 分析确定羰基还原酶氨基酸保守序列

2．3．2 选定探针序列

2．3．3 构建羰基还原酶候选酶库

2．3．4 目标酶获取

2．4 小结

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株和质粒

3．2．2 常用仪器

3．2．3 主要试剂及培养基

3．2．4 主要溶液配制

3．3 实验方法

3．3．2 B．cereus基因组DNA提取

3．3．3 PCR克隆羰基还原酶BcCR基因

3．3．4 质粒提取

3．3．5 大肠杆菌感受态细胞制备

3．3．6 表达载体构建

3．3．7 连接产物转化与筛选

3．3．8 目的基因测序

3．3．9 目的基因诱导表达

3．3．10 目的蛋白纯化

3．4 结果与讨论

3．4．1 羰基还原酶基因克隆

3．4．2 重组质粒构建及鉴定

3．4．3 测序结果

3．4．4 羰基还原酶诱导表达

3．4．5 目的蛋白纯化

3．5 小结

第四章 羰基还原酶酶学性质及全细胞催化研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株及质粒

4．2．2 主要试剂及仪器

4．3 实验方法

4．3．1 重组菌培养及粗酶液制备

4．3．2 粗酶液酶活测定

4．3．3 羰基还原酶BcCR酶学性质研究

4．3．4 重组菌全细胞催化COBE还原

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 重组酶最适温度

4．4．2 重组酶最适pH

4．4．3 酶热稳定性

4．4．4 金属离子对酶活影响

4．4．5 酶动力学参数测定

4．4．6 重组菌全细胞催化COBE还原

4．5 小结

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

附录