Bacillus paralicheniformis左聚糖蔗糖酶基因克隆表达及酶学性质研究

摘要

[目的]从耐热菌株中克隆表达左聚糖蔗糖酶基因,以获得热稳定性较好、底物耐受性高的重组酶,为左聚糖蔗糖酶催化机理及生产应用研究提供技术基础。[方法]从市售菌肥中筛选耐热菌株并克隆其左聚糖蔗糖酶基因,以pSE380为载体构建重组质粒并转化至大肠杆菌诱导表达,随后通过镍亲和层析获得电泳纯的重组左聚糖蔗糖酶并研究其酶学性质。[结果]分离到耐热菌株LN-05,经16S rDNA序列分析鉴定为Bacillus paralicheniformis。克隆表达的B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶与已公布地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19个氨基酸残基差异。重组酶催化水解反应最适pH为6.0,最适温度为45℃,于40和45℃保温3 h后残余酶活力分别为89%和78%。Mn^2+、Ag^3+和Cr^2+对重组左聚糖蔗糖酶的水解活力有明显抑制作用,Co^2+和Al3~+对水解活力具有一定促进效果;Ba^2+、Mg^2+和Mn^2+对聚合活力有明显抑制作用,Ag^3+、Cu^2+和K~+对聚合活力具有促进作用。EDTA对重组酶水解活力和聚合活力均具有抑制作用。在最适条件下,重组左聚糖蔗糖酶的最大反应速率(V(max))=74μmol/(min·mg),米氏常数(Km)为7.57 mmol/L。催化聚合反应的最适温度随着底物蔗糖浓度而变化,当蔗糖浓度为50%时,最适温度为40℃;最适聚合反应pH为5.0;当酶浓度为0.9 U/mL,在最适条件下反应24 h,左聚糖产糖量达183.00±1.73 g/L,蔗糖转化率为(36.76±1.84)%。[结论]B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的热稳定性较好,左聚糖产量高,具有转化蔗糖生产高附加值左聚糖的应用潜力。