热泉菌Bacillus sp. BI-19产耐高温脂肪酶的基因克隆及其酶学性质研究

摘要

热泉是耐高温脂肪酶的一个重要来源，它具有独特的生境环境，为嗜热微生物提供了良好的生存环境，耐高温脂肪酶具有良好的热稳定性、较高的反应速率等特点。耐高温的脂肪酶在生物催化上具有其他常温脂肪酶不可比拟的优点，特别是在洗涤行业具有较好的发展前景。因此，研究热泉微生物和其产生的耐高温脂肪酶具有重要的理论意义和生产前景。
　　本课题以印度洋卡利安达岛东海岸热泉样品为材料，通过样品稀释、平板划线、罗丹明B平板检测等方法，根据单菌落在罗丹明B平板上的透明圈直径大小，获得一株高产脂肪酶菌株BI-19;通过16S rRNA鉴定以及系统发育分析，发现其和Bacillus.sp亲缘关系较近，所以初步鉴定为芽孢杆菌属，并命名为Bacillus.sp BI-19。为提高Bacillus.sp BI-19的酶活，首先进行了培养条件优化，分别以不同培养pH、不同接种量、不同碳源、不同碳源浓度、不同氮源、不同氮源浓度、不同金属离子、不同的三丁酸甘油酯浓度和不同装液量作为唯一变量进行单因素实验。根据单因素的结果利用minitab软件设计PB实验，筛选出的对脂肪酶活性影响较为显著的三个影响因子（硫酸铵、KCl、三丁酸甘油酯），根据这三个影响因子设计最陡爬坡实验，最后利用Design-Expert软件设计响应面并分析，最终得到当硫酸铵的质量分数为0.65％，三丁酸甘油酯的浓度为0.03％，KCl的浓度为5.57mmol/L时，Bacillus.sp BI-19酶活最高，可达50.5U/ml，是优化前的2倍。
　　为实现Bacillus.sp BI-19产脂肪酶的高效异源表达，首先通过构建基因组DNA质粒文库的方法筛选获得了两个脂肪酶编码基因的完整开放阅读框(ORF)，分别命名为lip-0256和lip-1954。然后利用基因工程手段将脂肪酶基因lip-0256和lip-1954分别连接到表达载体pET-30(a+)中，并成功转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。两株重组菌破碎细胞上清酶活测定表明，重组酶Lip-1954酶活较Lip-0256高，且Lip-1954的可溶性表达可达50％，因此本论文以重组菌pET-30(a+)-lip-1954作为后续的研究菌株。
　　为研究重组酶Lip-1954的酶学性质，首先对重组酶Lip-1954进行纯化。因表达载体pET-30(a+)上具有His标签，所以本研究采用镍离子亲和层析对Lip1954进行分离纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳检测显示为较单一条带，在30KD左右，大小与预测一致。纯化后的Lip-1954的酶学性质研究表明，Lip-1954重组酶的最适反应温度为70℃，而且该酶在60～75℃时酶活还保持在50％左右的酶活;其最适pH为9，说明该酶属于碱性脂肪酶，在洗涤剂领域具有潜在应用;在反应体系中加入Cu2+、Cd2+、Sr2+、Mg2+、Na+、Fe3+、K+、Ca2+、Fe2+、Pb2+，其中Na+、Fe3+、Cd2+、K+、Fe2+对Lipase-1954具有促进作用，其中Fe3+的促进作用最为显著达到200％,而Cu2+、Sr+、Mg2+、Ca2+、Pb2+对Lip-1954具有抑制作用。重组酶Lip-1954对有机溶剂的耐受性研究结果表明，该酶对丙三醇（甘油）和正丁醇的耐受性较好，且对其催化活性具有促进作用，特备是在加入正丁醇的反应体系中，其酶活是未加有机溶剂的两倍;而在反应体系中加入甲醇、乙醇、三氯甲烷、石油醚、正己烷，其酶活也能保持在60％以上，表明Lip-1954对有机溶剂具有较好的耐受性。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 脂肪酶的简介

1．1．1 脂肪酶的来源

1．1．2 脂肪酶的结构和催化机理

1．1．3 脂肪酶的研究现状

1．1．4 脂肪酶的应用

1．2 耐高温脂肪酶

1．2．1 本论文耐高温脂肪酶的来源

1．2．2 耐高温脂肪酶的研究现状

1．3 本课题的研究目的和意义

第二章 产耐高温脂肪酶菌株的筛选和鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 材料和试剂

2．1．2 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 初筛

2．2．2 复筛

2．2．3 脂肪酶酶活的测定

2．2．4 基因组DNA的提取

2．2．5 16S rRNA基因的PCR扩增

2．2．6 系统发育树的构建

2．3 实验结果与分析

2．3．1 初筛与复筛

2．3．2 菌株BI-19号菌的种属鉴定

2．4 小结与讨论

第三章：Bacillus sp．BI-19菌株的发酵条件优化

3．1 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 试剂

3．2 试验方法

3．2．1 制备种子液

3．2．2 标准曲线的制备

3．2．3 菌株的生物量和酶活曲线

3．2．4 单因素实验

3．2．5 设计Plackett-Burman实验

3．2．6 最陡爬坡实验

3．2．7 Box-Behnken设计及结果

3．3 实验结果与分析

3．3．1 BI-19号菌株的生长曲线和产酶曲线

3．3．2 单因素实验结果

3．3．3 响应面分析结果

3．4 实验小结与讨论

第四章 Bacillus sp．BI-19菌株基因组DNA质粒文库的构建与耐高温脂肪酶基因的克隆

4．1 实验材料

4．1．1 菌株与常用软件

4．2．2 实验试剂

4．2 实验方法

4．2．1 基因组DNA提取

4．2．2 基因组DNA质粒文库的构建

4．2．3 产高温脂肪酶基因克隆的筛选

4．2．4 高温脂肪酶的基因序列分析

4．3 实验结果与分析

4．3．1 基因组DNA的提取

4．3．2 菌落PCR检测和测序验证

4．3．3 阳性克隆的筛选

4．3．4 脂肪酶基因的序列分析

4．4 实验小结与讨论

第五章 脂肪酶基因lip-1945和lip-0256的异源表达

5．1 实验材料与方法

5．1．1 实验菌株

5．1．2 实验仪器

5．1．3 实验试剂

5．2 试验方法

5．2．1 基因组DNA的提取

5．2．2 设计引物并引物PCR

5．2．3 琼脂糖凝胶回收

5．2．4 连接pMD18-T simple载体

5．2．5 质粒提取和PCR检测

5．2．6 双酶切和琼脂糖凝胶回收

5．2．7 连接到表达载体pET-30(a+)并PCR检测

5．2．8 转化入TDP10并测序

5．2．9 提取TOP10的质粒并转化入BL21中

5．2．10 耐高温脂肪酶的诱导表达

5．3 实验结果与分析

5．3．1 基因组DNA提取和引物PCR

5．3．2 重组酶的诱导表达结果

5．4 实验小结和讨论

第六章 重组酶Lip-1954的酶学性质研究

6．1 实验材料

6．1．1 菌株与仪器

6．1．2 主要试剂

6．2 实验方法

6．2．1 目的蛋白的分离纯化

6．2．2 重组酶的酶学性质研究

6．3 实验结果与分析

6．3．1 蛋白纯化

6．3．2 酶学性质研究

6．4 实验小结与讨论

第七章 总结和展望

参考文献

致谢

硕士期间发表文章