洋葱伯克霍尔德氏菌ATCC25416胞外碱性耐高温脂肪酶的原位表达和酶学性质研究

摘要

脂肪酶(triacylglycerol lipase EC3.1.1.3)是一种广泛存在的水解酶，能够催化甘油三酯酯键的断裂。碱性脂肪酶在碱性条件下具有很高的水解活性。由于具有反应效率高，反应条件温和，安全无毒等优点，碱性脂肪酶已被广泛应用于洗涤、制革、食品与纺织工。本论文从洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC25416中克隆得到胞外碱性脂肪酶全基因，并实现了脂肪酶基因在同源宿主中的高水平分泌表达，初步分离纯化后对脂肪酶酶学性质进行研究，为洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶的进一步理论研究及其应用奠定了基础。此外，本论文尝试了B.cepacia ATCC25416基因组文库的构建，希望通过文库的构建和筛选克隆得到该菌株表达的所有脂肪酶基因，对B.cepacia ATCC25416脂肪酶进行系统的研究。本论文主要研究包括：
　　 (1)以实验室保藏菌种B.cepacia ATCC25416基因组为模板，PCR扩增得到包含脂肪酶基因上游启动子序列，脂肪酶基因lipA，伴侣蛋白基因lipB以及lipB下游终止子序列，全长2333 bp。包含启动子的上游序列长143 bp。lipA开放阅读框长1095 bp，编码一个364个氨基酸残基的蛋白质，包括N末端44个氨基酸残基组成的信号肽。lipB开放阅读框长1035 bp，编码344个氨基酸残基的蛋白质，包括N末端70个氨基酸残基组成的起锚定作用的疏水序列。
　　 (2)构建同源表达重组质粒pBBRMCS1-lipAB，将重组表达质粒电转化B.cepaciaATCC25416。在相同发酵条件下，比较了野生型和重组型B.cepacia ATCC25416的发酵产酶情况，重组菌在发酵32 h时的胞外脂肪酶活力达到最高，为142 U/mL，野生菌在发酵40 h时的胞外脂肪酶活力达到最高，为70 U/mL。此外，在不同时间段重组菌胞外脂肪酶活力均明显高于野生菌。
　　 (3)将重组B.cepacia ATCC25416发酵上清经过硫酸铵沉淀，疏水色谱层析和阴离子交换层析后得到较纯的脂肪酶活性组分LipA。SDS-PAGE分析纯化后的LipA是加工过的产物，分泌表达的脂肪酶不含N端44个氨基酸残基组成的信号肽，只保留了320个氨基酸残基组成的成熟肽。分子量为33 kDa左右，与预测分子量相等。
　　 (4)通过对LipA酶学性质的研究，发现其最适反应pH和最适反应温度分别为11.0和60℃。该酶在30-70℃和pH9.0-11.5的环境中十分稳定，是碱性耐高温脂肪酶。该酶对C12-C16的长链脂肪酸酯水解活力较高，对三油酸甘油酯没有位置选择性。1 mMMg2+，Ca2+，Cu2+，Zn2+和Co2+对脂肪酶具有较好的激活作用，而1 mM PMSF， EDTA以及10 mM DTT与1mM SDS混合物强烈抑制脂肪酶的活力。非离子型表面活性剂对酶活具有激活作用，离子型表面活性剂对酶活具有轻微抑制作用。该酶在氧化剂过氧化氢中表现稳定，在低极性的苯环类有机溶剂以及非极性的烷烃类有机溶剂中有较高的活力和良好的稳定性。
　　 (5)基因组粘粒文库的初步构建确定了高分子量DNA(HMW DNA)的提取方法，用琼脂糖凝胶包埋、裂解和纯化的方法提取的基因组DNA长度远大于500 kb。考察了不同限制性内切酶对琼脂糖胶块内HMW DNA的不完全酶切作用，BamHI不完全酶切HMW DNA可以产生集中于20-30 kb的DNA片断，脉冲场电泳(PFGE)能够很好的分辨大于20 kb的DNA片断。文库的初步构建为获取高质量粘粒基因组文库以及目的基因的筛选和克隆奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 脂肪酶概述

1.2 假单胞菌脂肪酶研究进展

1.2.1 假单胞菌脂肪酶的生化特性

1.2.2 假单胞菌脂肪酶的应用

1.2.3 假单胞菌脂肪酶基因的克隆

1.2.4 假单胞菌脂肪酶分泌机制

1.2.5 假单胞菌脂肪酶的表达现状

1.3 基因组文库的构建

1.4 本课题研究背景、意义和课题来源

1.5 本课题研究思路和内容

1.5.1 课题研究思路

1.5.2 研究方法

1.5.3 研究内容

第二章 洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶基因的克隆及表达载体构建

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株与质粒

2.2.2 主要试剂

2.2.3 培养基与溶液

2.2.4 主要仪器

2.2.5 试验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 B.cepacia ATCC25416基因组DNA的提取

2.3.2 lipAB基因的获得

2.3.4 lipAB全基因序列及其蛋白序列

2.3.5 pBBRMCS1-lipAB表达载体的构建

2.4 本章小结

第三章 脂肪酶基因的原位表达，纯化及酶学性质的研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种与质粒

3.2.2 主要试剂

3.2.3 培养基与溶液

3.2.4 主要仪器

3.2.5 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 B.cepacia ATCC25416基因工程菌的构建

3.3.2 B.cepacia ATCC25416基因工程菌产脂肪酶的分析

3.3.3 基因工程菌产胞外脂肪酶的分离纯化

3.3.4 脂肪酶酶学性质的研究

3.4 本章小结

第四章 B.cepacia ATCC25416高分子量DNA的制备及酶切分析

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌种与质粒

4.2.2 主要试剂

4.2.3 溶液

4.2.4 主要仪器

4.2.5 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 洋葱伯克霍尔德氏菌HMW DNA的提取

4.3.2 HMW DNA的胶块内酶切

4.4 本章小结

主要结论

展望

致 谢

参考文献

附录： 作者在攻读硕士学位期间发表的论文