一种利用重组Bacillus subtilis克隆表达粘质沙雷氏菌脂肪酶的方法

摘要

一种利用重组Bacillus subtilis克隆表达粘质沙雷氏菌脂肪酶的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先获得粘质沙雷氏菌中脂肪酶(lipA)的基因扩增，然后利用pMA-5质粒，首次实现了该基因在模式菌株枯草芽孢杆菌168中的过量表达。本发明首次构建产粘质沙雷氏菌脂肪酶的枯草芽孢杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现经过培养基成分及培养条件的优化之后脂肪酶活为98.6U/mL，是出发菌8.57U/mL的12倍，脂肪酶的活力较出发菌株有了显著提高。本发明为微生物发酵法生产脂肪酶的工业化提供了积极的指导作用并且可用于食品工业领域中。

说明书

技术领域

一种利用重组Bacillus subtili克隆表达粘质沙雷氏菌脂肪酶的方法，尤其是一种安全高效的可用于食品工业的脂肪酶的表达方法，属于基因工程和酶工程领域。 

技术背景

脂肪酶(Lipase，全称Triacylglycerol acylhydrolase)EC3.1.1.3，是一类特殊的酯键水解酶。能催化水解三酰甘油为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯以及甘油，其天然底物一般是不溶于水溶液的长链脂肪酸酰基酯。脂肪酶在自然界中广泛存在，不仅有参与新陈代谢的重要的生理作用，而且有很大的工业价值，包括一些特殊有机物的合成，脂肪和油类的水解，食品工业发展中香料的改进，以及化学分析等。脂肪酶有很好的工业应用前景，一般是通过产胞外脂肪酶的微生物如细菌、真菌、酵母、放线菌等获得的，它在有机化学制品的加工处理、去垢剂的生产、生物表面活性剂的合成、牛奶工业、农用化学品工业、造纸、营养学、化妆品、制药工业等很多方面有广泛应用，还能促进脂类垃圾及聚亚安酯的降解。 

脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。目前脂肪酶的生产方法有三种： 

(1)提取法：自动植物器官或组织中提取酶； 

(2)化学合成法：通过分析酶的氨基酸组成顺序，然后用化学方法合成； 

(3)发酵法：利用微生物的生命活力，通过人工控制而获得人们所需的酶。 

微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、温度范围和更好的底物专一性，被广泛应用于传统和新型工业催化领域中。目前脂肪酶主要在食品加工、日化用品等行业取得迅猛发展，而在手性药物拆分、生物柴油方向研究较少。 

粘质沙雷氏菌可以分泌胞外脂肪酶，并且研究表明(Zhang-De Long，Jian-He Xu，Li-Li Zhao.Overexpression ofSerratia marcescens lipase in Escherichia coli for efficient bioresolution ofracemic ketoprofen.Journal ofMolecular Catalysis B：Enzymatic47(2007)105-110)这种脂肪酶具有较高的立体选择性，如能够专一性的拆分地尔硫卓合成过程中的关键中间体消旋反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯(MPGM)，得到(-)-MPGM，后者可进一步合成手性顺式(+)地尔硫卓。同时有研究显示粘质沙雷氏菌的脂肪酶基因在大肠杆菌中表达后具有较高的甲醇耐受性。说明粘质沙雷氏菌的脂肪酶可以很好的应用于手性药物合成及生物柴油领域，同时为了拓展其在食品加工等领域的应用，我们对其进行了在食品安全性佳及工业化发酵条件简单的枯草芽孢杆菌基因高效重组表达，为脂肪酶催化剂的最终形成及工业化奠定了坚实的技术基础。 

本发明通过质粒pMA-5，实现了粘质沙雷氏菌脂肪酶在枯草芽孢杆菌168中的过量表达，经过单因子实验和正交试验对重组菌的培养基组分及培养条件进行了优化，使其酶活达98.6U/mL，为原始菌酶活的12倍左右。同时枯草芽孢杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，是微生物脂肪酶发酵工业中的优质潜在生产菌株。 

发明内容

本发明的目的在于提供：一种通过基因工程手段来获得具有安全高效发酵生产粘质沙雷氏菌脂肪酶能力的微生物的方法。 

本发明的技术方案：是以基因工程为手段构建一株发酵生产粘质沙雷氏菌脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌，通过PCR及酶切验证，筛选阳性重组子，对重组的枯草芽孢杆菌进行发酵条件优化，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力。本发明成功构建了一株高产脂肪酶的枯草芽孢杆菌工程菌株并优化了其发酵条件，其脂肪酶活力较出发菌株有极大提高。 

重组菌株构建方法： 

(1)脂肪酶(lipA)基因全序列的克隆 

根据GENBANK网站公布的Serratia marcescens lipA基因序列以及pMA-5质粒上的酶切位点设计lipA基因引物。以制备的粘质沙雷氏菌染色体DNA为模板，通过PCR扩增出lipA全序列。 

PCR反应体系：10×ExTaq Buffer2.5μL，dNTP2μL，模板DNA1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH₂O补齐至总体积25μL。PCR反应条件：94℃4min，94℃90s，59℃90s，72℃120s，循环30次，72℃10min，15℃10min。 

(2)重组表达载体pMA-5-lipA的构建 

参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与pMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamHI/Nde I酶切释放出大小为2.7kb和1.8kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-lipA。 

提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-lipA和pMA-5，质粒pMD18-T-lipA和pMA-5经BamHI/Nde I双酶切，胶回收纯化，T₄DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamH I/NdeI双酶切后释放出大小为7.5kb和1.8kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMA-5-lipA。 

(3)重组质粒pMA-5-lipA化学转化法转化模式菌株Bacillus subtilis168中 

将经验证构建成功的重组质粒pMA-5-lipA用化学转化法转化至模式菌株Bacillus subtilis168中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。 

(4)重组菌株B.subtilis168/pMA-5-lipA阳性转化子的筛选； 

挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。 

(5)重组菌株B.subtilis168/pMA-5-lipA培养基条件的优化： 

a)根据种子生长曲线确定最佳种龄。 

b)选择添加可溶性淀粉、麦芽糖、环糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖为碳源来分析对菌体量 及脂肪酶产量的影响。当确定为某一种碳源后，同时通过改变该碳源浓度从10g/L-60g/L来得到最佳菌体量及脂肪酶产量的碳源浓度。 

c)选择添加酵母浸膏、牛肉浸膏、豆粕、大豆蛋白胨、玉米浆为有机氮源来分析对菌体量及脂肪酶产量的影响。当确定为某一种有机氮源后，同时通过改变该氮源浓度从5g/L-30g/L来得到最佳菌体量及脂肪酶产量的氮源浓度。 

d)选择添加尿素、氯化铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、硝酸铵为无机氮源来分析对菌体量及脂肪酶产量的影响。当确定为某一种无机氮源后，同时通过改变该氮源浓度从0.5g/L-3g/L来得到最佳菌体量及脂肪酶产量的氮源浓度。 

e)选择添加硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、硝酸钾、硝酸钠以及1∶1比例的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾为无机盐来分析对菌体量及脂肪酶产量的影响。当确定为某一种无机盐后，同时通过改变该无机盐浓度从1g/L-6g/L来得到最佳菌体量及脂肪酶产量的无机盐浓度。 

f)在以上单因素的基础上，设计正交试验来优化培养基的成分。实验采用的“四因素三水平”方案，选取的最优碳源，最优有机氮源，最优无机氮源，最优无机盐为考察因素，进行实验。 

(6)重组菌株B.subtilis168/pMA-5-lipA培养条件的优化： 

a)在优化培养基成分的基础上，考察初始pH对细胞生物量和AD转化率的影响，将培养基初始pH分别设定pH5.0-8.0测试其对酶体量及脂肪酶产量的影响。 

b)在优化培养基成分及初始pH的基础上，考察不同接种量对酶体量及脂肪酶的影响，将接种量分别设定1％-6％。 

(7)重组菌B.subtilis168/pMA-5-lipA酶活测定 

酶活测定方法：采用对硝基苯酚法。具体方法如下：A液：16.5mmol/L的对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)的异丙醇溶液。B液：含有0.4％Triton X-100和0.1％阿拉伯树胶的50mmol/L Tris-HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液以1∶9(体积比)比例混和，取100μL粗酶液加入900μL上述混合液中，于40℃反应10min。立即加1mL无水乙醇终止反应，于410nm下测定光吸收值。酶活(U)单位定义：每分钟分解p-NPP产生1μmol对硝基苯酚(黄色)所需的酶量定义为1个酶活单位。 

本发明的有益效果：通过基因工程手段扩增本实验已有的具有脂肪酶能力的粘质沙雷氏菌的该酶基因，借助本实验室有的枯草表达体系，首次实现了粘质沙雷氏菌来源的脂肪酶基因在模式菌株枯草芽孢杆菌168中的过量表达。将该菌株接种于以2％接种量接种于50mL LB培养基中，培养36h，从碳源、有机氮源、无机氮源及无机盐的角度对培养基成分进行优化，得到最佳优化条件，同时确定最佳培养条件，然后离心取上清，菌体洗涤两次，用适当的PBS(PH7.5)缓冲液悬浮，超声波破碎细胞。总酶活约为98.6U/mL，是发酵条件优化前的3倍，约是出发菌8.57U/mL的12倍。 

粘质沙雷氏菌所产的胞外脂肪酶可应用于手性化合物的不对称合成。如可以高效地选择性拆分地尔硫卓(Diltiazem)生产中的关键中间体-肖旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯(MPGM)，得到(2R，3s)-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯-(-)-MPGM，后者作为起始合成原料可以直接合成手性顺式(+)地尔硫卓。此外，粘质沙雷氏菌脂肪酶对甲醇、乙醇等有机溶剂有较高的耐受性。因此在生物柴油和医药方面有很大应用前景，同时由于其在枯草体系中的表达使其具有潜在食品加工等领域的应用前景。 

附图说明

图1重组菌B.subtilis168/pMA-5-lipA的酶切验证 

M1：λHindIII DNA Marker；1：pMA-5-lipA单酶切；2：pMA-5-lipA双酶切；M2：DS2000Marker 

图2重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA-5-lipA的SDS-PAGE验证 

M：Unstained protein MW marker of Takara，1：B.subtilis168/pMA5-lipA细胞破碎上清，2：B.subtilis168细胞破碎上清，3：B.subtilis168/pMA5-lipA发酵液上清，4：B.subtilis168发酵液上清 

具体实施方法 

实施例1：重组B.subtilis168菌株的构建 

1)脂肪酶(lipA)基因全序列的克隆：根据GENBANK网站公布的Serratia marcescenslipA基因序列以及pMA-5质粒上的酶切位点设计lipA基因引物。引物序列如下(其中斜体下划线部分为酶切位点，引物由赛百盛公司合成)。 

lipA F·5’-ATCGAATTCATGGGCATCTTTAGCTATA-3’ 

lipA R：5’-TGACTGCGCCGGCTTAGGCCAACACCACCTG-3’ 

粘质沙雷氏菌染色体DNA的提取制备参照上海生工公司小量染色体DNA提取试剂盒(细菌)使用说明书，将提取的染色体DNA置于-20℃冰箱待用。以制备的粘质沙雷氏菌染色体DNA为模板，以lipAF、lipAR为引物，通过PCR扩增出lipA全序列。 

PCR反应体系：10×ExTaq Buffer2.5μL，dNTP2μL，模板DNA1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH2O补齐至总体积25μL。PCR反应条件：94℃4min，94℃90s，59℃90s，72℃120s，循环30次，72℃10min，15℃10min。 

2)重组表达载体pMA-5-lipA的构建：参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，回收的PCR产物通过进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收产物按一定比例与pMD18-T vector过夜连接，将检测的PCR产物按以下比例，与克隆载体进行连接，16℃过 夜。连接体系：Solution I5μL；PCR产物4.8μL；pMD18-T0.2μL。转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamH I/Nde I酶切释放出大小为2.7kb和1.8kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-lipA。 

提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-lipA和pMA5，质粒pMD18-T-lipA和pMA-5经BamH I/Nde I双酶切，胶回收纯化，T4DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamH I/NdeI双酶切后释放出大小为7.5kb和1.8kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMA-5-lipA。 

3)重组质粒pMA-5-lipA化学转化法转化模式菌株B.subtilis168中：将经验证构建成功的重组质粒pMA-5-lipA用化学转化法转化至模式菌株B.subtilis168中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。第一天晚上挑取宿主菌接种于10mL LB液体培养基，37℃摇床培养过夜。第二天早上取100μL过夜培养的菌液，接种于5mL SP I培养基中，37℃摇床培养，5小时后开始测OD600，当培养物生长到对数术期时，快速取200μL接种到2mL SP H培养基中，37℃、160rpm摇床培养1.5h。加20μL100×EGTA溶液，于37℃160rpm摇床培养10min，用1.5mL离心管分装成500μL每管。向管中加入适量验证好的质粒(5-10μL)，轻轻混匀，于37℃160rpm摇床培养2h。以8000rpm离心收集菌体，去掉部分上清液，留200μL重悬菌体，涂布于卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养。将验证好的重组质粒pMA-5-lipA，按照上述的转化方法转化B.subtilis168，构建重组枯草芽孢杆菌重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA-5-lipA。 

4)重组菌株B.Subtilis168/pMA-5-lipA阳性转化子的筛选：挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，转接至含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、160rpm摇床培养10-12h发酵，提取转化子质粒进行酶切验证，得到重组菌的酶切验证图(如图1)。 

5)重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA-5-lipA产酶分析：将验证好的重组的枯草芽孢杆菌菌株B.subtilis168/pMA-5-lipA和接种至含50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃振荡培养24h，然后按1％接种量转接至新鲜50mL LB液体培养基，培养24h。取培养24h的菌液50mL，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，用50mL pH7.4的50mM PBS缓冲液洗涤二次，重悬于4ml的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间10min。10000rpm离心30min获得上清液。发酵液离心后上清，细胞破碎上清和细胞破碎沉淀分别进行SDS-PAGE(如图2所示)及酶活测定。 

实施例2：重组菌株B.subtilis168/pMA-5-lipA发酵条件的优化 

重组菌株B.subtilis168/pMA-5-lipA培养基条件的优化： 

a)根据种子生长曲线确定生长13-15h的种子为最佳种龄。 

b)选择添加可溶性淀粉、麦芽糖、环糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖为碳源来分析对菌体量及脂肪酶产量的影响。浓度2％，初始发酵培养基为LB培养基。由于LB培养基中没有严格意义上的碳源，可将备选碳源作为唯一碳源直接加入，其他组分保持不变。接种量2％，37℃、160rpm培养36h，测定其菌体量并测定脂肪酶酶活发现蔗糖为碳源时，脂肪酶产量最高，且菌体量相对较高。同时在其他条件不变情况下通过改变蔗糖浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L培养，发现在蔗糖浓度为10-30g/L时菌体量和脂肪酶产量随蔗糖浓度升高呈上升趋势，随后开始下降，确定蔗糖浓度为30g/L有利于菌体量及脂肪酶产量的提高。c)选择添加酵母浸膏、牛肉浸膏、豆粕、大豆蛋白胨、玉米浆为有机氮源来分析对菌体量及脂肪酶产量的影响。浓度2％，初始发酵培养基为LB培养基，用待选有机氮源替换掉原始培养基中的氮源，其他组分不变。接种量2％，37℃、160rpm培养36h，测定其菌体量及脂肪酶酶活发现玉米浆最佳。同时在其他条件不变情况下通过改变玉米浆浓度分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L培养发现浓度为25g/L的玉米浆可以得到最佳菌体量及脂肪酶产量。 

d)选择添加尿素、氯化铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、硝酸铵为无机氮源来分析对菌体量及脂肪酶产量的影响。浓度2％，初始发酵培养基为LB培养基，用待选无机氮源替换掉原始培养基中的氮源，其他组分不变。接种量2％，37℃、160rpm培养36h，测定其菌体量及脂肪酶酶活发现硫酸铵最佳。同时在其他条件不变情况下通过改变硫酸铵浓度分别为0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L中培养发现浓度为1.5g/L的硫酸铵可以得到最佳菌体量及脂肪酶产量。 

e)选择添加硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、硝酸钾、硝酸钠以及1∶1比例的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾为无机盐来分析对菌体量及脂肪酶产量的影响。浓度0.25％。初始发酵培养基为LB培养基。由于LB培养基中存在无机盐氯化钠，所以选取的无机盐直接替换掉原始无机盐即可，其它组分都保持不变。接种量1％，培养温度37℃，摇床转速160rpm，培养，测定其菌体量及脂肪酶产量发现氯化钙最佳。同时在其他条件不变情况下通过改变氯化钙浓度分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L中培养发现浓度为4g/L的氯化钙能得到最佳菌体量及脂肪酶产量。 

f)在以上单因素的基础上，设计正交试验来优化培养基的成分。实验采用的“四因素三水平”方案，选取的最优碳源，最优有机氮源，最优无机氮源，最优无机盐为考察因素，进行实验。最终确定蔗糖35g/L，玉米浆27.5g/L，硫酸铵1.25g/L，氯化钙4g/L是培养基成分最佳。采用此最优组合的发酵培养基培养菌体，测其所产脂肪酶活。 

重组菌株B.subtilis168/pMA-5-lipA培养条件的优化： 

a)在优化培养基成分的基础上，考察初始pH对菌体量及脂肪酶产量的影响，将培养基初始pH分别设定pH5.0、6.0、7.0、8.0培养，pH为5.0时，菌体生长受到抑制，同时脂肪酶产量较低；pH为6.0-7.0时菌体量及脂肪酶产量较高，其中pH为7.0时为最佳。 

b)在优化培养基成分及初始pH的基础上，考察不同接种量对酶体量及脂肪酶的影响，将接种量分别设定1％、2％、3％、4％、5％、6％，得到最佳接种量为4％。 

实施例3：重组菌株的酶活力测定 

菌株在LB培养基中培养36h，8000rpm离心10min，取上清。A液：16.5mmol/L的对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)的异丙醇溶液。B液：含有0.4％Triton X-100和0.1％的阿拉伯树胶的50mmol/LTris-HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液以1∶9(体积比)比例混和，取100μL粗酶液加入900μL上述混合液中，于40℃反应10min。立即加1mL无水乙醇终止反应，于410nm下测定光吸收值。酶活(U)单位定义：每分钟分解p-NPP产生1μmol对硝基苯酚(黄色)所需的酶量定义为1个酶活单位。 

将初生菌按2％(V/V)的接种量转接到初始发酵培养基中，37℃、160rpm培养24h测定其酶活为8.57U/mL。之后对重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA-5-lipA产酶进行酶活测定为32.24U/mL。在最优发酵培养基的条件下，37℃、160rpm摇床培养33h重组菌脂肪酶产量可达98.6U/mL发酵液，约是优化前的3倍，是出发菌的约12倍。