嗜热链球菌抗噬菌体机制及基于CRISPR1位点分型研究

摘要

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是发酵乳行业最重要的工业发酵剂之一，它比乳杆菌更易受到噬菌体的污染，给发酵乳工业生产带来巨大的经济损失。筛选具有噬菌体不敏感型菌株（Bacteriophage insensitive mutant, BIM）和对其抗噬菌体机制研究是至关重要的。成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）是原核生物抵抗外源基因片的一种自身免疫系统，广泛的存在于古菌和细菌中。研究表明 CRISPR位点是原核生物与其噬菌体长期斗争的结果，记录着原核生物受噬菌体侵害的进化历程，可以用作原核生物分类的标准。
　　本研究通过采用琼脂平板法（agar plate method, AP method）和次级生长法（secondary culture method, SC method）对出发菌株 StI02筛选具有噬菌体7p、Ip、Z3p、001p抗性的嗜热链球菌，共筛选出11株具有噬菌体抗性的菌株，这11株BIM具有稳定的遗传性能并且连续传20代未发生回复突变。对这11株 BIM菌株抗性机制研究发现：它们不含有质粒，抗性机制与吸附率和 R-M系统无关，而与嗜热链球菌的 CRISPR-Cas系统有关，在分析11株 BIM的 CRISPR1位点序列时，除了 BIM StK-V1没有获得新的间区序列（space sequence, S sequence）序列外，其余10个 BIM均获得1-2个新的 S序列。而就是这些新插入的 S序列使他们具有噬菌体抗性。获得 S序列9个，均来自于噬菌体基因组序列。对11个BIM进行发酵性能研究发现，这些抗性菌株的产酸能力均能达到工业生产要求，对这11个 BIM菌株进行胶体缩水敏感性（susceptiblility to synersis, STS）、持水力（water holding capacity, WHC）、和粘度测定时发现大多数 BIM在这三个方面的指标均低于敏感菌株，只有 BIM K-II1和 K-VI2菌株在这三个方面均与敏感菌株相当，甚至单一指标优于敏感菌株。
　　结合 M17培养基筛选、麦芽糖发酵和菌落特异 PCR，从光明市售酸奶、缅甸酸奶、内蒙古奶豆腐和鲜奶中共分离鉴定出嗜热链球菌32株。其中光明市售酸奶中分离出菌株22株，缅甸酸奶中分离出1株，内蒙古奶豆腐中分离得到5株，鲜奶中分离得到4株。从 NCBI数据库下载获得48株嗜热链球菌的 CRISPR1位点序列。对77株嗜热链球菌 CRISPR1位点序列进行 S序列标记分析，总共分析 S序列1693个，独立存在 S序列589个，未重复出现的 S序列有258个。对菌株按3’末端相同的 S序列进行分型，总共分了15个 CRISPR型，分别为CR23型、CR41型、CR75型、CR187型、CR274型、CR385型、CR408型、CR324型、CR399型、CR441型、CR159型、CR110型、CR209型、CR229型和 CR485型。采用 MEGA分别对 CR41型、CR75型、CR187型、CR274型、CR385型、CR408型、CR324型、CR399型、CR441型菌株进行了 UPGMA进化树分析，进一步证明了 CRISPR1位点序列分型具有可行性和可信性。

目录

声明

缩略语表（Abbreviation）

第一章 绪论

1嗜热链球菌

2嗜热链球菌噬菌体

3 选题的目的和意义

第二章 抗噬菌体嗜热链球菌的抗性机制及性能研究

1.引言

2.实验材料

3 实验方法

4 结果分析

5 小结

6 讨论

第三章 基于CRISPR1 位点对嗜热链球菌分型

1 引言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果分析

5 小结

6讨论

第四章 总结与展望

1 总结

2 展望

参考文献

致谢

硕士期间研究成果