外源性EETs通过Toll-NF-κB信号通路抑制FFA诱导3T3-L1脂肪细胞和RAW264.7巨噬细胞引起的炎症反应

摘要

研究背景和目的:花生四烯酸(arachidonicacid,AA)是人体内广泛分布的一种多不饱和脂肪酸,是机体内最为丰富的物质之一。经细胞色素P450(CYP450)表氧化酶途径代谢成四种具有重要生物活性的内源性物质,即5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET。EETs具有广泛且很强的生物活性,在机体内发挥着重要作用,包括降压、抗炎、抗凋亡、抗心肌损伤和抗动脉粥样硬化作用。
　　代谢综合征是指生活方式因素及新出现的突发危险因素相互影响所产生的一种复合性疾病,具备腹围升高、甘油三酯(TG)升高、高密度脂蛋白降低、胆固醇(HDL-C)升高、血压升高、空腹血糖(FPG)升高这5项危险因素中3项及以上者定义为代谢综合征。研究表明肥胖是一种慢性炎症,其能激活炎症基因网络,炎症基因网络的激活很可能是代谢综合征的重要的病理生理基础,在代谢综合征发生和发展中起重要作用。FFA与代谢综合征和代谢综合征5个组分中的腹部肥胖、高TG血症、高血压、高血糖4个组分均相关,提示FFA是代谢综合征的发病基础或危险因素之一。肥胖者通常伴随血浆游离脂肪酸(FFA)水平增高,这是因为肥胖造成脂肪组织增加后更趋向于分解代谢。大量的研究证明,FFA与炎症信号通路之间存在着内在联系。最近的研究已经表明游离脂肪酸可作为先天免疫受体TLR4的内源性配体,激活其下游的促炎症转录因子NF-kB,FFA引起炎症反应很可能是通过TLR4,这可能是FFA引起炎症反应的机制之一。
　　在本研究中,我们假设过外源性EETs干扰FFA诱导细胞引起的炎症表达,从而在改善脂肪组织的慢性炎症状态,在预防代谢综合征的进展中具有重要的保护作用。FFA可以诱导3T3-L1细胞、RAW2647.1细胞引起炎症通路的激活及炎症因子的分泌增加,我们进一步研究外源性EETs是否能够干预此过程及其可能的分子机制,旨在明确EETs是否能够减轻脂肪组织炎症,进而为进一步研究EETs是否能够延缓代谢综合征的进展提供证据。
　　实验方法:按照诱导分化方案将3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,分化结果用油红O染色鉴定。FFA为实验组作用于细胞,加或不加外源性EETs及抑制剂,收集细胞mRNA,用Real-timePCR方法检测各组TNF-α,IL-6,MCP-1mRNA表达水平;用WesternBlot方法检测各组pIKBα和胞浆及核NF-κB蛋白表达水平;细胞水平高表达TLR4,加或不加14,15EET,收集细胞mRNA,用Real-timePCR检测各组TNF-α,IL-6,MCP-1mRNA表达水平;用WesternBlot方法检测各组pIKBα和胞浆及核NF-κB蛋白表达水平;并用SPSS13.0统计学软件分析。综合判断外源性EETs是否影响FFA诱导细胞引起的炎症反应及其可能的分子机制。
　　实验结果:对于3T3-L1细胞及RAW264.7细胞,与FFA组比较,8,9-EET,11,12-EET,14,15-EET组TNFα、MCP-1、IL-10表达水平降低(P<0.05),pIKBα、核NF-κB表达减少,而这种降低效应在加入TLR4抑制剂后消失。而在3T3-L1细胞及RAW264.7细胞高表达TLR4,加入14,15-EET后,TNFα、MCP-1、IL-10表达水平降低(P<0.05),pIKBα、核NF-κB表达减少。
　　结论:1.外源性EETs能够抑制FFA刺激脂肪细胞和巨噬细胞引起的炎症因子IL-6、TNF-a、MCP-1的分泌增加。2.外源性EETs能够抑制FFA刺激脂肪细胞和巨噬细胞后引起NF-κB炎症信号通路的激活,其作用机制很可能是通过Toll样受体4来实现的。

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中文摘要

英文摘要

研究背景

实验材料及试剂

一、主要实验材料：

二、主要实验试剂：

三、主要设备：

实验方法

一、3T3-L1细胞的传代培养及分化

二、RAW264.7细胞培养

三、质粒的大量提取（碱裂解法）

五、实时定量PCR检测细胞中的炎症因子IL-6，TNF-α，MCP-1的mRNA表达水平

六、Western blot检测相关蛋白质的表达

七、统计学分析

实验结果

一、3T3-L1诱导分化结果

二、外源性EET抑制FFA诱导3T3-L1细胞和RAW264.7细胞引起的炎症因子分泌的增加及炎症信号通路的激活

讨论

全文总结

一、研究结果

二、本实验的不足之处及进一步深入研究计划

参考文献

文献综述

参考文献

致谢