FFA作用于脂肪细胞Toll-NF-КB信号通路机制研究

摘要

目的：肥胖患者脂肪组织增加后更趋向于代谢分解,造成血浆游离脂肪酸(FFA) 水平增高和细胞内脂质积聚，肥胖被认为是一种慢性炎症状态。本研究首先培养3T3-L1前脂肪细胞并将其诱导分化为成熟脂肪细胞，用一定浓度游离脂肪酸（FFA）刺激脂肪细胞，检测FFA是否影响TLR4的表达以及进一步能否介导NF-κB信号通路，最终出现炎症因子分泌增强。
　　 方法：3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞(油红O染色鉴定)。用脂多糖（LPS）作为阳性对照，用ω-3多不饱和脂肪酸(EPA)作为阴性对照，FFA为实验组作用于成熟脂肪细胞，收集细胞用Real-time PCR检测各组TLR4 mRNA表达水平；收集细胞全蛋白用Western Blot检测各组TLR4和NF-κB蛋白表达水平；抽提核蛋白用EMSA检测各组NF-κB的活性；收集细胞培养上清液用ELISA检测各组TNF-α，IL-6，MCP-1等细胞因子的表达，并用SPSS13．0统计学软件分析。综合判断FFA是否影响LR4的表达以及FFA能否通过TLR4介导NF-κB炎症信号通路。
　　 结果：
　　 1.本研究通将3T3-L1前脂肪细胞诱导成脂肪细胞用于实验。3T3-L1是国际上公认的研究脂肪细胞分化的细胞模型，实验人员熟练掌握了诱导方法，可保证稳定的细胞诱导成熟率。
　　 2.通过Real-time PCR方法从mRNA水平检测TLR4的表达情况，得出结果为：FFA的mRNA相对量为2.1，EPA的mRNA相对量为1.2，LPS的mRNA相对量为2.7，空白组的mRNA相对量为1。一定游离脂肪酸的刺激下可使脂肪细胞TLR4的mRNA表达量低于阳相对照组，高于阴性对照组和空白对照组。
　　 3.用一定浓度的FFA刺激脂肪细胞，并分别用LPS阳性对照、EPA阴性对照和空白对照，通过Western-blot检测TLR4的蛋白水平表达情况，脂肪细胞TLR4的蛋白表达量低于阳相对照组，高于阴性对照组和空白对照组。
　　 4.用一定浓度的FFA刺激脂肪细胞，并分别用LPS阳性对照、EPA阴性对照和空白对照，通过Western-blot从蛋白水平检测NF-κB的表达情况。得出结果为：一定游离脂肪酸的刺激下可使脂肪细胞NF-κB的蛋白表达量低于阳相对照组，高于阴性对照组和空白对照组。
　　 5.用一定浓度的FFA刺激脂肪细胞，并分别用LPS阳性对照、EPA阴性对照和空白对照，通过EMSA方法从转录活性水平检测NF-κB的转录活性情况。得出结果为：一定游离脂肪酸的刺激下可使脂肪细胞NF-κB有较强转录活性。
　　 6.用一定浓度的FFA刺激脂肪细胞，并分别用LPS阳性对照、EPA阴性对照和空白对照，通过ELISA方法检测细胞培养上清液中IL-6、TNF-a、MCP-1的浓度及变化趋势。得出结果为FFA组和LPS组MCP-1浓度较平行在2小时候浓度有明显上升，EPA组和空白对照组MCP-1浓度较平行，FFA组MCP-1浓度与空白对照组MCP-1浓度比较在4h、6h、8h、10h、12h均有差别（P<0.05）。
　　 7.各组间IL-6浓度趋势基本为LPS>FFA>空白对照>EPA。FFA组IL-6浓度与空白对照组在8h前无差别（P>0.05），在第10h时LPS组为224.03±18.96pg/mL，FFA组为199.13±3.55pg/mL空白对照为171.83±6.47 pg/mL，EPA为126.20±4.35pg/mL，FFA组与空白对照组出现差别（P<0.05）。
　　 8.LPS组TNF-a浓度明显高于其他三组，EPA组和空白对照组TNF-a浓度较为接近。FFA组TNF-a浓度与空白对照组浓度比较在4h、6h、8h、10h、12h均有差别（P<0.05）。
　　 结论：
　　 1.用一定浓度的FFA刺激脂肪细胞后，可使TLR4从mRNA水平和蛋白水平的表达增强。
　　 2.FFA刺激脂肪细胞后可激活NF-κB炎症信号通路。
　　 3.FFA刺激脂肪细胞后炎症因子IL-6、TNF-a、MCP-1分泌浓度有不同程度的增加。