一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法

摘要

本发明提供一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，将猪胚胎成纤维细胞以4~6×10

说明书

技术领域

本发明公开一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，将猪胚胎成纤维细胞转化脂肪细胞，属于细胞诱导技术领域。

背景技术

由于临床治疗的需要，人们需要特殊分化的细胞来治疗疾病，所以干细胞诱导及分化技术逐渐成熟，但随之发现，一些细胞能够不通过干细胞状态直接分化成另一种类型的分化细胞，所报道的方法都是以转基因的手段来实现的，直接将终末分化的细胞转化为其他类型的功能细胞：如将胚胎成纤维细胞、成软骨细胞和视网膜上皮细胞转变为具收缩特性的肌细胞；将Β淋巴细胞转变为巨噬细胞；将胰岛外分泌细胞转化为β胰岛细胞样细胞；将小鼠成纤维细胞转化为功能性的神经细胞；将小鼠心肌内成纤维细胞重新编程为心肌细胞来修复受损的心脏。由于诱导细胞编程都是以转基因为主，其转基因后导致的外源基因插入突变对生物安全性有严重的影响，并且该方法获得的细胞在疾病治疗或者器官移植中都是不可用的，这就导致了目前的方法只适用于研究而不适用于临床治疗。

目前，对脂肪细胞分化及调控方面的研究主要使用体外分化系统。现在已经建立起来的最有代表性的两个前脂肪细胞系是Green和Kehinde从17－19天小鼠胚胎的中胚层多能干细胞中分离并诱导分化出来的，即3T3-F442A和3T3-L1小鼠前脂肪细胞系，当用适当的诱导剂进行诱导刺激时，约经过一周左右的时间就可分化成为充满着脂肪滴的脂肪细胞。如利用该方法得到脂肪细胞，就必须预先分离得到前脂肪祖细胞，这就使得获得脂肪细胞的难度大大增加，并且前脂肪细胞在动物体内含量较少且不易分离纯化，所以人们通常使用前脂肪细胞系由于研究，但其作为一种成系细胞，具有一定的致瘤性，并不适用于疾病治疗。

发明内容

本发明提供一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，通过细胞信号通路抑制剂作于细胞，获得的猪脂肪细胞没有外源基因的插入，解决了转基因后导致的外源基因插入突变对生物安全性影响的问题。

本发明的技术解决方案如下：

将猪胚胎成纤维细胞以4~6×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到Corning细胞培养板中，使用诱导培养基培养；37℃，5％CO₂培养箱中培养20天时，对细胞进行观察并油红O染色，可发现油红O着色细胞，证明其确实为脂肪细胞；

诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.2-1μM SB431542 (Stemgent)。

所述细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，还可加入0.5-2μM通路抑制剂Thiazovivin后使其效率增加。

细胞信号通路抑制剂SB431542和Thiazovivin分别作用于TGF-β/smad信号通路和ROCK信号通路。Smad3能够与通过C/EΒPβ的Mad homology 1区域的结合，影响C/EΒPβ与DNA的结合，从而抑制其活性，抑制脂肪细胞转化。因此通过细胞信号通路抑制剂SB431542的处理，可以抑制TGF-β/smad信号通路的活性，促进脂肪细胞的形成。而ROC家族成员能够直接调节细胞骨架中的肌动蛋白进行重组，还能够调节如细胞能动性、粘附力、胞质分裂等多种与肌动蛋白细胞骨架相关的细胞功能。ROCK介导的Rho信号肽是通过磷酸化某些参与肌动蛋白丝组装及收缩的底物来调节肌动蛋白细胞骨架的。而在脂肪形成的过程中丝状的肌动蛋白结构发生改变，从长的张力纤维变成皮质肌动蛋白。因此抑制ROCK信号通路可促进脂肪细胞的形成。

本发明的积极效果在于：利用细胞信号通路抑制剂而非转基因来诱导细胞转化，可有效的防止细胞基因组因插入外源基因而导致的基因突变。同时该方法对于研究脂肪细胞的形成机制有一定的促进作用，其简便性和安全性可被广泛的应用，可用于脂肪形成机制的研究，也能在疾病治疗等临床应用上发挥作用。

附图说明

图1 为实施例1诱导得到的脂肪细胞；

图2 为实施例1诱导得到的脂肪细胞油红O染色；

图3为实施例1RT-PCR分析脂肪特异基因表达；

图4 为实施例1细胞免疫荧光染色分析脂肪特异基因表达；

图5 为实施例2诱导得到的脂肪细胞油红O染色；

图6 为实施例3诱导得到的脂肪细胞油红O染色；

图7 为实施例4诱导得到的脂肪细胞油红O染色；

图8 为实施例5诱导得到的脂肪细胞油红O染色；

图9 为实施例6诱导得到的脂肪细胞油红O染色；

图10 为实施例7诱导得到的脂肪细胞油红O染色；

图11 为实施例8诱导得到的脂肪细胞油红O染色。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1 

0.5μM细胞信号通路抑制剂SB431542可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞

将猪胚胎成纤维细胞以5×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.5μM SB431542 (Stemgent)。37℃，5％CO₂培养箱中培养。

结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成（参见图1、图2）。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，猪脂肪特异性基因（PPARγ，C/EBPα、β、δ，LPL，AP2，Adipoq，CFD，SLC2A4）经PCR后分别为172，130，148，127，150，114，229，88，83bp处出现特异性条带，细胞免疫荧光呈阳性。证明0.5μM 的SB431542能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为：17.3%。

参见图3、：20天时，诱导的到的脂肪细胞表达脂肪特异性基因，β-actin作为对照。特异基因PPARγ，C/EBPα、β、δ，LPL，AP2，Adipoq，CFD，SLC2A4，β-actin片段的大小分别为172，130，148，127，150，114，229，88，83，173 bp。

图4：用三种脂肪特异性基因蛋白抗体对诱导得到的脂肪细胞进行免疫荧光染色，从左到右分别为：亮视野对照；DAPI染色；细胞免疫荧光染色。

实施例2 

0.2μM细胞信号通路抑制剂SB431542可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞

将猪胚胎成纤维细胞以5×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.2μM SB431542 (Stemgent)。37℃，5％CO₂培养箱中培养。

结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明0.2μM 的SB431542能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为：15.8%。参见图5.

实施例3 

1μM细胞信号通路抑制剂SB431542可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞

将猪胚胎成纤维细胞以5×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1μM SB431542 (Stemgent)。37℃，5％CO₂培养箱中培养。

结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明1μM 的SB431542能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为：19.2%。参见图6。

实施例4 

0.5μM细胞信号通路抑制剂SB431542和0.5μM细胞信号通路抑制剂Thiazovivin可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞

将猪胚胎成纤维细胞以5×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.5μM Thiazovivin (Stemgent)，0.5μM SB431542 (Stemgent)。37℃，5％CO₂培养箱中培养。

结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明同时加入0.5μM SB431542和0.5μM Thiazovivin能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为：25.5%。参见图7。

实施例5 

0.5μM细胞信号通路抑制剂SB431542和1μM细胞信号通路抑制剂Thiazovivin可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞

将猪胚胎成纤维细胞以5×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1μM Thiazovivin (Stemgent)，0.5μM SB431542 (Stemgent)。37℃，5％CO₂培养箱中培养。

结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明同时加入0.5μM SB431542和1μM Thiazovivin能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为：27.0%。见图8.

实施例6 

0.5μM细胞信号通路抑制剂SB431542和2μM细胞信号通路抑制剂Thiazovivin可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞

将猪胚胎成纤维细胞以5×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，2μM Thiazovivin (Stemgent)，0.5μM SB431542 (Stemgent)。37℃，5％CO₂培养箱中培养。

结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明同时加入0.5μM SB431542和2μM Thiazovivin能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为：27.4%。见图9.

实施例7

猪胚胎成纤维细胞密度为4×10⁴个/ cm²时经细胞信号通路抑制剂SB431542(0.5μM)诱导可转化成为脂肪细胞

将猪胚胎成纤维细胞以4×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.5μM SB431542 (Stemgent)。37℃，5％CO₂培养箱中培养。

结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明猪胚胎成纤维细胞密度为4×10⁴个/ cm²时经诱导能够得到脂肪细胞，计算得到的效率为：15.9%。见图10.

实施例8 

猪胚胎成纤维细胞密度为6×10⁴个/ cm²时经细胞信号通路抑制剂SB431542(0.5μM)诱导可转化成为脂肪细胞

将猪胚胎成纤维细胞以6×10⁴个/ cm²的比例均匀的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为：15%（v/v）Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培养基，0.1mM非必须氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.5μM SB431542 (Stemgent)。37℃，5％CO₂培养箱中培养。

结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明猪胚胎成纤维细胞密度为6×10⁴个/ cm²时经诱导能够得到脂肪细胞，计算得到的效率为：16.7%。见图11。

通过以下试验例证明本发明的效果：

试验例1   油红O染色鉴定猪脂肪细胞

1试验过程  在20天时对诱导的细胞进行油红O染色。首先使用10%甲醛(V_甲醛：V_水=1:9)固定30min，用60%异丙醇(V_异丙醇：V_水=3:2)清洗、晾干，然后0.6g/ml油红O染色30min，用30%异丙醇(V_异丙醇：V_水=3:7)快速清洗一遍，最后用蒸馏水清洗五遍后用显微镜观察。

2 试验结果  油红O染料可与脂肪细胞特异性的结合。所以猪胚胎成纤维细胞经油红O染色不着色，脂肪细胞的脂滴可被油红O染成红色。结果表明在显微镜下可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明其确实是脂肪细胞。 

试验例2   油红O染色测定脂肪细胞的形成效率

1试验过程  在20天时对诱导的细胞进行油红O染色后。在同组的3个细胞培养板中（10X20）倍显微镜下随机选取10个视野（1.35mm²）进行油红O染色细胞计数，取得平均数后计算每平方厘米（cm²）的脂肪细胞数目，除以起始的细胞密度（4~6×10⁴个/ cm²），得到的结果即诱导效率。

试验例3   RT-PCR检测猪脂肪细胞特异基因的表达

1 试验过程  提取诱导20天的细胞总RNA作为模板，利用猪脂肪特异性基因（PPARγ，C/EBPα、β、δ，LPL，AP2，Adipoq，CFD，SLC2A4）的引物进行RT-PCR鉴定。采用Trizol（Invitrogen）试剂提取RNA，采用SuperScript IIIFirst-Strand SynThiazovivinesis System（Invitrogen）反转录试剂盒获得cDNA，PCR反应采用Taq DNA polymerase（Fermentas）试剂。具体操作步骤参照说明书。PCR产物委托北京天根公司进行测序，证明其序列正确。

RT-PCR反应的引物和大小分别为：

基因上游引物 (5’ to 3’)下游引物 (5’ to 3’)Amplicon Size (bp)PPARγCTGACCAAAGCAAAGGCGAGACCCCTGAAAGATGCGAATG172C/EBPαCAAGAACAGCAACGAGTAGTCATTGTCACTGGTCAG130C/EBPβCAGCGACGAGTACAAGATCTGCTCCACCTTCTTCTG148C/EBPδGCTATCGTCAGGTCAGTTATCTCCATAATCAGTGTCCAA127LPLGCGTGTGGCTTCAGAGTCCAGGAATGAGATGGCAAGTGT150AP2CGAACTCTACAACACTCTGACCAACAAGCATATTGAACA114adipoqACTTGAAGGATGTGAAGGTATGTTGTGGTAGAGAAGGAA229CFDCATGATCTCCTCCTGCTGAAGCCTCGTGGTCCTCTCGTT88SLC2A4AGTATGTTGCGGATGCTATAGGAAGGTGAAGATGAAGAA83β-actinGAACCCCAAAGCCAACCGTCCTCGTAGATGGGCACCGT173

2 试验结果　猪脂肪特异性基因（PPARγ，C/EBPα、β、δ，LPL，AP2，Adipoq，CFD，SLC2A4）经PCR后分别为172，130，148，127，150，114，229，88，83bp处出现特异性条带。证明脂肪特异基因表达，证明诱导得到的细胞是脂肪细胞。

试验例4   细胞免疫荧光染色检测猪脂肪细胞特异基因的表达

1 试验过程  将诱导20天的细胞利用4%（m/v）多聚甲醛室温固定30min，PBS清洗2遍，随后浸泡在0.1%(m/v)TritonX-100（穿孔液,使用PBS配置）中，室温静置30min对细胞进行打孔，增加通透性，滴加5%（v/v）正常山羊血清（封闭液，使用穿孔液配制），室温封闭30min，滴加一抗（1：500）（v/v）4℃孵育过夜（封闭液稀释一抗），之后PBST洗3次每次10min，最后滴加二抗（1：64）（v/v）（PBS配制），避光孵育2h。PBST洗3次每次10min。DAPI（1：1000）（v/v）（PBS稀释）复染5min，PBST洗涤2次每次5min。利用激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况。一抗采用猪脂肪细胞特异基因蛋白（PPARγ，C/EBPα、β）的抗体。

2 试验结果　诱导后的细胞经免疫荧光染色后在488nm的激发光下检测并拍照记录。如发出黄绿色荧光，证明抗体能够与细胞中相应蛋白结合；如不能发出黄绿色荧光，则细胞中没有蛋白与抗体结合。改方法能够直接反应脂肪特异基因的表达情况，证明脂肪细胞的形成。