酪蛋白肽及其苦味肽功能特性的研究

摘要

酪蛋白肽具有多种生物活性而备受关注，但苦味问题是制约其广泛应用的一个瓶颈。酪蛋白肽的苦味主要是由其所含的一些疏水性氨基酸的肽(苦味肽)导致，目前大多脱苦方法是将苦味肽去除或降解。但一些苦味肽也是生物活性肽，故在研究脱苦方法的同时，更应考虑到其合理利用。本文以Alcalase酶解酪蛋白肽中的苦味肽为主要研究对象，对其疏水性、分子量分布、氨基酸组成及序列等方面进行了研究，同时对水相、醇相酪蛋白肽的功能特性进行了比较。在此基础上，采用复配酶分步水解工艺制备出低苦味、高水解度的短肽，对其经过膜分离的不同分子量肽段组分的功能特性进行了研究，以明确各个不同分子量酪蛋白肽组分的主要活性及功能特性，为寻求苦味肽有效、合理的脱除方法及合理应用不同分子量酪蛋白肽提供理论依据。 首先筛选适宜蛋白酶及酶解工艺的优化，即分别用庞博木瓜蛋白酶、庞博中性蛋白酶、Neutrase、Alcaltase、Protamex和胰蛋白酶水解酪朊酸钠，Alcalase酪蛋白肽的三氯乙酸可溶性氮含量和水解度最高且苦味较低。在对Altcaltase水解过程中加酶量、底物浓度、pH、反应温度和反应时间的单因素研究基础上，通过均匀试验设计建立了酪蛋白肽水解度与其中四种影响因素的回归模型。最终确定Altcaltase酶解酪朊酸钠的参数最优组合为：水解时间199min，加酶量4240U/gpro.,pH值10.38，温度50℃。在此条件下，实际得到酪蛋白肽的水解度为24.27％，三氯乙酸可溶性氮含量为79.85％，平均肽链长度为4.12，平均分子量为471.23，苦味值为2.53。 对异丁醇萃取酪蛋白肽中苦味肽的方法进行了优化，并分析了不同水解度苦味肽的组成。采用Alcalase在加酶量4240U/gpro.、pH10.38、温度50℃条件下，制备水解度为10％、15％和20％的酪蛋白肽。对不同条件下异丁醇萃取苦味肽的研究表明，酪蛋白肽浓度为20％、异丁醇添加量为50％、pH自然条件下，能有效萃取出酪蛋白肽中的苦味肽。在此条件下制各了三种水解度的苦味肽CNH-A-10、CNH-A-15和CNH-A-20。对其分子量分布的研究发现，它们是一些分子量分布较广但以小分子为主的肽和少量游离氨基酸的混合物。对其氨基酸组成的研究表明：与源蛋白相比，苦味肽中含有更多的组氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸等，必需氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支链氨基酸的含量均有所增加；苦味肽的游离氨基酸不足总氨基酸的1％，其中脯氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的含量较高，而甲硫氨酸、赖氨酸等含量较低，必需氨基酸和疏水性氨基酸含量占有较大比例，碱性氨基酸和芳香族氨基酸的含量相对较少。 采用生物质谱技术对CNH-A-10和CNH-A-20进行了基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和反相高效液相色谱与电喷雾电离飞行时间质谱联用(RP-HPLC-ESI-MS)分析。由于样品组分复杂且受各种因素的影响，前者结果不理想。后者由于先分离后分析，得到了较丰富的肽的氨基酸序列信息。RP-HPLC-ESI-MS测定的苦味肽肽段统计结果表明：苦味肽基本上是由一些氨基酸残基数低于30个、分子量小于4000Da的小肽组成，随着水解的进行，其疏水性氨基酸不断从肽链的中间位置暴露到肽链两端，甚至游离出来，使苦味降低。 对酪蛋白肽、醇相肽和水相肽进行了功能特性的比较研究。在Alcalase最适酶解条件下制备了酪蛋白肽，再用异丁醇萃取得到了水相肽、醇相肽。三样品的RP-HPLC分析表明：酪蛋白肽是亲水性与疏水性肽段组成的混合物，水相肽中大部分为亲水性强的组分，而醇相肽中主要为疏水性强的组分。对三样品的理化特性研究表明：在pH2-11的广泛范围内溶解性都较好，乳化性、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性极显著低于酪朊酸钠(p＜0.01)。对三样品的生理活性研究表明：酪蛋白肽对超氧阴离子自由基(O2-)、DPPH·自由基和羟自由基(·OH)均有一定程度的清除作用，在亚油酸体系中也具有抗氧化活力，水相肽对超氧阴离子自由基(O2-)和羟自由基(·OH)的清除率较高，而醇相肽对DPPH自由基的清除及其在亚油酸体系中抗氧化能力较强；三样品对假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌都有不同程度的抑制作用，水相肽与醇相肽相比，前者对假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和藤黄微球菌的抑制作用较强，而后者对枯草芽孢杆菌的抑制作用较强；酪蛋白肽及其水相肽、醇相肽血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性均在80％以上，其中水相肽的抑制率最高；由于具有阿片活性的酪啡肽β-Casomorphin-5和β-Casomorphin-7为平均疏水度较高的小肽，因此大部分存在于醇相萃取的组分中，而水相中含量较少。 在单酶水解基础上确立了蛋白酶复配分步水解的工艺，以降低酶解物的苦味值和提高蛋白的水解度。首先用Alcalase对酪朊酸钠水解，然后从庞博木瓜蛋白酶、庞博中性蛋白、Neutrase和Protamex中选取一种酶对Alcalase酶解物进一步水解。木瓜蛋白酶水解物的TCA-SNI和DH最高且苦味最低，故选择木瓜蛋白酶。据木瓜蛋白酶水解的单因素及均匀试验的研究结果确定TCA-SNI最高时的优化组合条件为：加酶量2461U/gpro.,pH5.94，温度57.4℃。以上条件下获得的酪蛋白短肽三氯乙酸可溶性氮含量为87.75％，水解度为27.31％，平均肽链长度为3.66，平均分子量为420.6，苦味值为1.01。 应用膜分离技术将酪蛋白短肽分离成不同分子量范围的组分，并研究了各组分的功能特性。先用截留分子量分别为3500Da和1000Da的膜将酪蛋白短肽分离成分子量大于3500Da(A)、小于3500Da大于1000Da(B)和小于1000Da(C)的三个部分。RP-HPLC分析表明，A、B为亲水性和疏水性肽的混合物，C在液相色谱上保留时间较短，主要为亲水性的小肽。A、B、C的苦味值均在2以下。A有较好的溶解性，乳化性及乳化稳定性高于酪朊酸钠，而起泡性和泡洙稳定性稍低于酪朊酸钠。B、C均有良好的溶解性，乳化性及乳化稳定性、起泡性及泡沫稳定性都极显著低于酪朊酸钠和A(p＜0.01)。 生理活性研究表明：A、B、C对超氧阴离子自由基(O2-)、DPPH·自由基和羟自由基(·OH)均有一定程度的清除作用，在亚油酸体系中也具有抗氧化活力，其大小依次为B、C、A；A、B、C对假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌都有不同程度的抑制作用，其中对假单胞菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的抑制效果较好；A、B、C对ACE均有一定程度的抑制作用，随着分子量的减小，ACE抑制活性呈增大趋势，其中C对ACE的抑制活性最高，为96.01％；A、B、C的βCasomorphin-5和β-Casomorphin-7含量都较低。

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第一章绪论

1.1酪蛋白的概述

1.1.1酪蛋白的营养价值

1.1.2酪蛋白的结构特点

1.1.3酪蛋白的综合利用

1.1.4存在的问题

1.2生物活性肽的定义及其吸收机制

1.2.1生物活性肽的定义

1.2.2生物活性肽的吸收机制

1.3生物活性肽的功能特性

1.3.1理化特性

1.3.2生物活性

1.4生物活性肽的制备方法

1.4.1提取法

1.4.2水解法

1.4.3合成法

1.5蛋白水解物苦味产生的机理

1.6影响苦味产生的因素

1.6.1底物的选择

1.6.2蛋白酶的筛选

1.6.3水解度的控制

1.6.3酶解肽中疏水性氨基酸的构成

1.7苦味脱除的方法

1.7.1选择分离法

1.7.2包埋掩盖法

1.7.3类蛋白法

1.7.4生物脱苦法

1.8苦味肽的功能活性

1.9生物活性肽的应用及其存在的问题

1.9.1生物活性肽的应用

1.9.2产业化中存在的问题

1.10立题意义和主要研究内容

第二章水解酶的筛选及Alcalase酶解工艺的优化研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1试剂与材料

2.2.2主要设备

2.2.3试验方法

2.3结果与讨论

2.3.1酪朊酸钠的组成

2.3.2蛋白酶活力的测定结果

2.3.3蛋白酶的筛选

2.3.4 Alcalase水解酪蛋白的单因素试验

2.3.5 Alcalase水解酪蛋白的均匀试验结果

2.3.6 Alcalase酶解酪蛋白肽的TCA-SNI及苦味值的测定

2.4本章小结

第三章Alcalase酶解酪蛋白苦味肽组成的研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1试剂与材料

3.2.2主要设备

3.2.3试验方法

3.3结果与讨论

3.3.1酪蛋白肽的组分

3.3.2酪蛋白肽的平均肽链长度和平均分子量

3.3.3酪蛋白肽的TCA-SNI及苦味值

3.3.4异丁醇提取条件的研究

3.3.4苦昧肽在三种水解度样品中的含量

3.3.5分子量分布的测定结果

3.3.6总氨基酸的测定结果

3.3.7游离氨基酸的测定结果

3.4本章小结

第四章Alcalase酶解酪蛋白肽中苦味肽的质谱分析

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2主要设备

4.2.3试验方法

4.3结果与讨论

4.3.1 MALDI-TOF-MS的测定结果

4.3.2 RP-HPLC-ESI-MS的测定结果

4.3.3 RP-HPLC-ESI-MS测定的苦味肽统计结果

4.4本章小结

第五章Alcalase酶解酪蛋白肽不同相组分功能特性研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1试剂

5.2.2主要设备

5.2.3试验方法

5.3结果与讨论

5.3.1酪蛋白肽中不同组分的制备

5.3.2不同组分液相色谱的测定

5.3.3不同组分理化特性的测定结果

5.3.4不同组分生理活性的测定结果

5.4本章小结

第六章复配酶分步水解法制备酪蛋白短肽工艺的研究

6.1引言

6.2材料与方法

6.2.1试剂与材料

6.2.2主要设备

6.2.3试验方法

6.3结果与讨论

6.3.1复配蛋白酶的筛选

6.3.2复配酶的单因素试验

6.3.3复配酶的均匀设计试验

6.3.4复配酶酶解酪蛋白短肽DH和苦味值的测定

6.4本章小结

第七章酪蛋白短肽不同分子量组分功能特性的研究

7.1引言

7.2材料与方法

7.2.1主要材料

7.2.2主要设备

7.2.3试验方法

7.3结果与讨论

7.3.1酪蛋白肽的超滤分离

7.3.2不同组分RP-HPLC的测定结果

7.3.3不同组分理化特性的测定结果

7.3.4不同组分生理活性的测定结果

7.4本章小结

第八章结论

8.1论文主要结论

8.2展望

创新点

参考文献

附录

致谢

作者简历