Penicillium purpurogenum Li-3产β-葡萄糖醛酸苷酶的研究及其在毕赤酵母中的初步表达

摘要

产紫青霉P. purpurogenum Li-3所产β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS)具有高度底物特异性,能定向水解甘草酸(GL)生成单葡萄糖基甘草次酸(GAMG),但该菌株产酶过程中存在碳代谢阻遏现象影响目标酶的表达与总活力的提高。对P. purpurogenum Li-3产酶的表达调控模式进行了研究,结果表明:碳代谢阻遏作用发生在基因转录前水平；根据已知真菌中碳代谢阻遏调控蛋白CreA的基因序列保守区设计简并引物,从P. purpurogenum Li-3中扩增获得大小为930 bp的片段，经克隆测序知,该片段编码的氨基酸序列与A. niger和A. orzye中CreA蛋白氨基酸序列同源性为88.42%,初步证明P. purpurogenum Li-3中存在CreA蛋白,且可能参与该菌株的产酶调控过程。同时对课题组前期构建的PGUS真核表达系统(毕赤酵母GS115-GUS)的诱导产酶条件及重组酶(PGUS-P)的酶学性质进行了研究:最佳诱导时间为4 d,最佳甲醇添加量为每12 h添加0.5%（V/V）,所得PGUS-P最大酶活为6.50×104 U/mL,比酶活为1.23×105 U/mg；该基因工程菌具有良好的遗传稳定性和PGUS-P表达的稳定性；PGUS-P催化甘草酸的反应动力学常数Km为0.48 mM,最大反应速度Vmax为0.133 mM/min；最适反应温度为37.5 ℃,最适pH值为5.0；Mg2 ＋、Mn2＋和Na＋对PGUS-P活力促进作用较明显,Ag＋和SDS对酶活有较强的抑制作用；PGUS-P水解甘草酸的催化反应模式与PGUS有所不同,能同时生成GAMG和甘草次酸两种产物,并以甘草次酸为终产物。