青霉菌Penicillium sp.聚半乳糖醛酸酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

摘要

果胶酶是一类分解果胶的酶的总称。聚半乳糖醛酸酶是果胶酶的一种,属于果胶水解酶类,属于糖苷水解酶28家族(GH28)。聚半乳糖醛酸酶作为果胶酶家族中的主要成员,它能够以随机方式水解果胶光滑区的α(1→4)糖苷键,迅速降低果胶粘度,在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术和饲料等方面应用广泛,聚半乳糖醛酸酶的研究具有重要的理论意义和实用价值。
　　 本研究从来源于腐败柑橘的样品中筛选到一株产聚半乳糖醛酸酶的菌株FJ2,通过菌落观察和18 S rDNA分子鉴定,鉴定该菌株属于青霉菌属(Penicillium sp.)。通过对聚半乳糖醛酸酶蛋白序列的多序列比对,找到了保守基序并设计简并引物,以Penicillium sp.FJ2的基因组DNA为模板,简并引物PCR扩增得到保守区核酸序列。进一步使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)扩增得到侧翼未知序列,进而得到一个聚半乳糖醛酸酶基因的全长序列。使用GENSCAN和NCBI Blastx分析基因中内含子的位置和数量,然后利用重叠PCR得到基因的cDNA序列。该基因全长1225bp,包含2个内含子,其cDNA全长1104 bp,编码367个氨基酸和一个终止密码子,前18个氨基酸为信号肽序列,有三个潜在的糖基化位点:298 NGS,318 NVT和336NGS。将无信号肽编码序列的基因cDNA命名为pgp1。pgp1基因连接表达载体pET30a(+)转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达后为包涵体形式。pgp1基因连接表达载体pPIC9,在巴斯德毕赤酵母表达系统中成功进行了异源分泌表达。在3 L发酵罐水平,培养基上清中聚半乳糖醛酸酶活力达到700 U／mL。经糖苷水解酶H水解糖苷链分析,毕赤酵母表达的PGP1有部分糖基化现象。酶学性质测定表明,重组酶蛋白PGP1的最适pH为5.0,在pH4.0～6.0下处理1 h后,剩余酶活力超过90％；最适温度为38℃；以聚半乳糖醛酸为底物,测得PGP1的Km=1.172±0.169 mg／mL聚半乳糖醛酸,Vmax=0.061±0.002 mg／min／mL。PGP1的酶活力不受Na+、K+和EDTA的影响。而SDS和CTAB会强烈的抑制酶的活力,相反Triton会增强酶的活力。在含10mmol／L Mg2+的条件下会使酶活力丧失约50％,而10 mmol／L的Ca2+、Co2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+会完全抑制酶的活力。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略表

1 引言

1.1 果胶

1.1.1 果胶在自然界中的分布

1.1.2 果胶的结构和化学组成

1.1.3 聚半乳糖醛酸

1.1.4 聚鼠李半乳糖醛酸及有取代基的聚半乳糖醛酸

1.2 聚半乳糖醛酸酶

1.3 聚半乳糖醛酸酶的结构和功能

1.4 微生物来源的聚半乳糖醛酸酶基因间的同源性比较

1.5 聚半乳糖醛酸酶的用途

1.5.1 果蔬汁的生产和果酒的澄清

1.5.2 废水处理

1.5.4 饲料行业

1.5.5 生物农药

1.6 巴斯德毕赤酵母(PICHIA PASTORIS)表达体系

1.6.1 巴斯德毕赤酵母表达系统表达系统的优点

1.6.2 巴斯德毕赤酵母表达系统表达载体

1.6.3 巴斯德毕赤酵母表达系统局限性及解决策略

1.7 本研究的目的和意义

2 聚半乳糖醛酸酶产生菌的筛选

2.1 材料与方法

2.1.1 样品、菌株和质粒

2.1.2 工具酶和试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 培养基及相关溶液配制

2.1.5 实验方法

1.5.2 菌株鉴定

2.2 结果

2.2.1 菌株富集培养和筛选

2.2.2 菌种鉴定

2.3 讨论

3 聚半乳糖醛酸酶基因的克隆

3.1 材料与方法

3.1.1 菌种和质粒

3.1.2 工具酶和试剂

3.1.3 实验仪器

3.1.4 培养基和相关溶液配制

3.1.5 所用引物序列

3.1.6 青霉菌Penicillium sp.FJ2基因组DNA的提取

3.1.7 聚半乳糖醛酸酶基因全长的扩增策略

3.1.8 聚半乳糖醛酸酶pgp1基因cDNA全长的克隆

3.1.9 聚半乳糖醛酸酶基因pgp1的序列分析及相似性比较

3.1.10 重组蛋白PGP1同源建模分析

3.2 结果

3.2.1 聚半乳糖醛酸酶序列比对及保守区简并引物的设计

3.2.2 聚半乳糖醛酸酶cDNA序列pgp1的获取

3.2.3 聚半乳糖醛酸酶基因pgp1的序列分析及相似性比较

3.2.4 重组蛋白PGP1同源建模分析

3.3 小结

3.4 讨论

4 聚半乳糖醛酸酶基因的表达

4.1 材料与方法

4.1.1 菌种和质粒

4.1.2 培养基

4.1.3 试剂及仪器

4.1.4 聚半乳糖醛酸酶酶活力测定方法

4.1.5 大肠杆菌表达载体的构建及诱导表达

4.1.6 PGP1包涵体的溶解

4.1.7 包涵体的重折叠

4.1.8 毕赤酵母感受态细胞的制备

4.1.9 毕赤酵母表达载体的构建

4.1.10酵母转化

4.1.11产内切聚半乳糖醛酸酶重组毕赤酵母的初筛

4.1.12产聚半乳糖醛酸酶重组毕赤酵母的复筛

4.1.13摇床水平各转化子聚半乳糖醛酸酶的表达

4.1.14发酵罐水平聚半乳糖醛酸酶的表达

4.1.15毕赤酵母表达的PGP1蛋白糖基化分析

4.2 结果

4.2.1 聚半乳糖醛酸酶活性测定

4.2.2 聚半乳糖醛酸酶cDNA重组质粒的鉴定

4.2.3 pgp1基因在大肠杆菌中的诱导表达

4.2.4 PGP1包涵体的溶解和重折叠

4.2.5 pgp1基因在毕赤酵母表达系统中的诱导表达

4.2.6 毕赤酵母表达的PGP1糖基化分析

4.3 小结

4.4 讨论

5 聚半乳糖醛酸酶PGP1酶学性质的分析

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 方法

5.2 结果

5.2.1 重组酶蛋白PGP1的纯化

5.2.2 PGP1酶学性质的测定

5.3 小结

5.4 讨论

6 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢