一种牛大力花不同发育时期的化学成分检测方法

摘要

本发明提供了一种牛大力花不同发育时期的化学成分检测方法和分离方法。本发明采用超高效液相色谱结合特定的流动相和洗脱程序能够从各个花期的蔓性和直立性牛大力花中分离出225个化合物，进一步采用四极杆‑静电场轨道阱高分辨质谱的分析方法，快速地对225个化合物进行了鉴定。结果表明，牛大力花中含有丰富的黄酮类、三萜类、有机酸类、氨基酸类和糖类等活性成分和营养物质，具有很强的生态学意义，开发利用价值较高。本发明丰富了牛大力的化学成分，并为其药理活性及开发利用研究奠定基础，同时提供了多个化合物的新的制备方法，丰富了化合物的来源。

说明书

技术领域

本发明涉及化学成分分析技术领域，具体涉及一种牛大力花不同发育时期的化学成分检测方法。

背景技术

牛大力为豆科鸡血藤属植物美丽鸡血藤Callerya speciosa(Champion exBentham)Schot的干燥根，主产我国广东、广西和海南等地，具有补虚润肺、强筋活络、提高免疫等功能，是岭南地区著名的食药两用植物，应用时以日常药膳为主，以中药方剂为辅，包括壮腰健肾丸、活络止痛丸和舒筋健丸等。目前，牛大力的功效研究和产品开发主要围绕地下块根(薯)开展，地上部位较少被关注。在民间，有以牛大力花煲汤或做茶饮、鲜花饼的食用习惯。牛大力在开花期白色的花朵缀满枝条，具有花期长、花量大和花穗长的特点，并且与地下根的生长密切相关。研究表明，牛大力中含有黄酮、三萜、生物碱、脂肪酸，以及多糖、氨基酸、维生素等多种活性物质。植物生长发育过程中存在库源关系，且有效成分在不同器官与组织中不断合成并会发生转移，随着时空发生动态变化，那么理清牛大力花的化学成分，对于研究牛大力地上部位化学成分与地下根(薯)化学物质积累的关系，牛大力去花处理的可行性，以及牛大力花资源的科学开发和合理利用都有重要意义。

本发明以2种植株形态(蔓性和直立性)牛大力的花为对象，收集了花蕾期、初花期、盛开期和凋萎期4个发育时期的样本。基于植物代谢组学的分析方法，采用UPLC-Q-Exactive MS技术，对花的初生代谢物、次生代谢物和挥发性物质进行分析、鉴定，使用正交偏最小二乘法判别分析、主成分分析和层次聚类分析等方法进行差异分析，以期探明不同生长发育时期牛大力花化学物质组成和变化规律。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种牛大力花化学成分的检测方法，能够有效分离和不同发育时期的牛大力花中的化学成分。

本发明的第一个方面是提供一种牛大力花化学成分的检测方法，以花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花为检测对象，采用超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱进行测定。

其中，超高效液相色谱的条件为：

色谱柱为100mm×2.1mm，1.8μmWaters ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱；柱温：42-48℃；体积流量：0.25-0.45mL/min；流动相：流动相A为体积浓度0.05-0.15％甲酸水溶液；流动相B为体积浓度0.005-0.015％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱。

优选地，洗脱梯度如下：

0～2min，95％流动相A，5％流动相B；

2～4min，95％→70％流动相A，5％→30％流动相B；

4～8min，70％→50％流动相A，30％→50％流动相B；

8～10min，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；

10～14min，20％→0％流动相A，80％→100％流动相B；

14～15min，0％流动相A，100％流动相B；

15～15.1min，0％→95％流动相A，100％→5％流动相B；

15.1～16min，95％流动相A，5％流动相B。

其中，在采用超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱进行测定前，将检测对象采用醇水溶液进行提取制成待测样品。

优选地，所述醇水溶液中的醇为甲醇和/或乙醇。

优选地醇水溶液中醇的体积百分比为5-95％，优选为10-90％，更优选为30-80％，更优选为50％-70％。

优选地，超高效液相色谱的条件中，所述柱温为45℃；所述体积流量为0.3-0.4mL/min，优选为0.35mL/min；流动相A为体积浓度0.08-0.12％甲酸水溶液，优选为体积浓度0.1％甲酸水溶液；流动相B为体积浓度0.008-0.012％甲酸乙腈溶液，优选为体积浓度0.01％甲酸乙腈溶液。

其中，超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱中的质谱仪的质谱条件为：采用电喷雾离子源(ESI)，分别采用正、负离子模式检测。优选地，正离子模式：喷雾电压3.8kV，鞘气流量40arb，辅助气流量10arb。优选地，负离子模式：喷雾电压3.0kV，鞘气流量35arb，辅助气流量8arb。优选地，毛细管温度为320℃，以70000分辨率进行全扫描，采用高能诱导裂解进行二级裂解，分辨率为17500，扫描范围为m/z 70～1000Da。

采用本发明的高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱从花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花分离化合物情况如下表1所示。

本发明的第二个方面是提供一种牛大力花化学成分的分离方法，以花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花为分离对象，采用超高效液相色谱进行分离。

其中，超高效液相色谱的条件为：

色谱柱为100mm×2.1mm，1.8μmWaters ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱；柱温：42-48℃；体积流量：0.25-0.45mL/min；流动相：流动相A为体积浓度0.05-0.15％甲酸水溶液；流动相B为体积浓度0.005-0.015％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱。

优选地，洗脱梯度如下：

0～2min，95％流动相A，5％流动相B；

2～4min，95％→70％流动相A，5％→30％流动相B；

4～8min，70％→50％流动相A，30％→50％流动相B；

8～10min，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；

10～14min，20％→0％流动相A，80％→100％流动相B；

14～15min，0％流动相A，100％流动相B；

15～15.1min，0％→95％流动相A，100％→5％流动相B；

15.1～16min，95％流动相A，5％流动相B。

其中，在采用超高效液相色谱进行分离前，将分离对象采用醇水溶液进行提取制成待测样品。

优选地，所述醇水溶液中的醇为甲醇和/或乙醇。

优选地醇水溶液中醇的体积百分比为5-95％，优选为10-90％，更优选为30-80％，更优选为50％-70％。

优选地，超高效液相色谱的条件中，所述柱温为45℃；所述体积流量为0.3-0.4mL/min，优选为0.35mL/min；流动相A为体积浓度0.08-0.12％甲酸水溶液，优选为体积浓度0.1％甲酸水溶液；流动相B为体积浓度0.008-0.012％甲酸乙腈溶液，优选为体积浓度0.01％甲酸乙腈溶液。

采用本发明的超高效液相色谱能够从花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花分离化合物情况如下表1所示，表1中+表示能够分离得到，-表示不能分离得到。

本发明的第三个方面是提供一种化合物的制备方法，所述化合物如表1所示，采用超高效液相色谱从花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花分离得到，表1中+表示能够分离得到，-表示不能分离得到。

其中，超高效液相色谱的条件为：

色谱柱为100mm×2.1mm，1.8μmWaters ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱；柱温：42-48℃；体积流量：0.25-0.45mL/min；流动相：流动相A为体积浓度0.05-0.15％甲酸水溶液；流动相B为体积浓度0.005-0.015％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱。

优选地，洗脱梯度如下：

0～2min，95％流动相A，5％流动相B；

2～4min，95％→70％流动相A，5％→30％流动相B；

4～8min，70％→50％流动相A，30％→50％流动相B；

8～10min，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；

10～14min，20％→0％流动相A，80％→100％流动相B；

14～15min，0％流动相A，100％流动相B；

15～15.1min，0％→95％流动相A，100％→5％流动相B；

15.1～16min，95％流动相A，5％流动相B。

其中，在采用超高效液相色谱进行分离前，将分离对象采用醇水溶液进行提取制成待测样品。

优选地，所述醇水溶液中的醇为甲醇和/或乙醇。

优选地醇水溶液中醇的体积百分比为5-95％，优选为10-90％，更优选为30-80％，更优选为50％-70％。

优选地，超高效液相色谱的条件中，所述柱温为45℃；所述体积流量为0.3-0.4mL/min，优选为0.35mL/min；流动相A为体积浓度0.08-0.12％甲酸水溶液，优选为体积浓度0.1％甲酸水溶液；流动相B为体积浓度0.008-0.012％甲酸乙腈溶液，优选为体积浓度0.01％甲酸乙腈溶液。

本发明采用超高效液相色谱结合特定的流动相和洗脱程序能够从各个花期的蔓性牛大力花和直立性牛大力花中分离出225个化合物，进一步采用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱的分析方法，快速地对225个化合物进行了鉴定，以黄酮类、三萜类和苯丙素类等次生代谢物为主，包含少量氨基酸、糖等初级代谢产物。结果表明，牛大力花中含有丰富的黄酮类、三萜类、有机酸类、氨基酸类和糖类等活性成分和营养物质，具有很强的生态学意义，开发利用价值较高。本发明丰富了牛大力的化学成分，并为其药理活性及开发利用研究奠定基础，同时提供了多个化合物的新的制备方法，丰富了化合物的来源。

附图说明

图1为不同发育时期牛大力花的形态。

图2为不同发育时期牛大力花质谱分析的基峰图。其中，A为Neg-负离子模式，B为Pos-正离子模式。

图3为不同发育时期牛大力花的代谢组学分析。图a-PCA得分图(模型参数R

图4为不同发育时期牛大力花的层次聚类分析。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1材料与仪器

Q-Exactive高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，ACQUITY UPLCI-Class plus高效液相色谱仪(美国Waters公司)，F-060SD型超声波清洗机(深圳福洋科技集团有限公司)，Wonbio-E型全自动样品快速研磨仪(上海万柏生物科技有限公司)，TGL-16MS型台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪仪器有限公司)，LNG-T98型冷冻浓缩离心干燥器(太仓市华美生化仪器厂)。

标准品(内标)：L-2-氯苯丙氨酸，购自上海恒创生物有限公司；二十四烷酸甲酯/木蜡酸甲酯C

试验样品采集于海南省儋州市农业农村部儋州热带药用植物种质资源圃，经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所王祝年研究员鉴定为豆科鸡血藤属植物美丽鸡血藤Callerya speciosa(Champion ex Bentham)Schot。牛大力花于2022年6月采摘，包括2种植株形态：蔓性和直立性，根据开放状态分为四个时期：Ⅰ期(花蕾期)、Ⅱ期(初花期)、Ⅲ期(盛开期)和Ⅳ期(凋萎期)，如图1所示。每个时期的重复取样数为6，采摘后液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。

2方法

2.1UPLC-Q-Exactive MS分析

液质代谢组学样品制备：称取80mg样本并将其置于1.5mL离心管中，再向其中加入20μL内标(L-2-氯-苯丙氨酸，0.06mg/mL，甲醇配置)以及800μL预冷70％甲醇(含L-2-氯-苯丙氨酸，2μg/mL)，-40℃放置2min后再研磨2min，冰水浴超声提取30min，-40℃静置过夜。取出样本，低温离心10min(13000r/min，4℃)，取150μL的上清液0.22μm针孔过滤器过滤，装入进样小瓶，可进行代谢组学分析。质量控制(quality control，QC)样本由所有样本的提取液等体积混合制备而成。

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm×1.8μm)，柱温45℃，体积流量0.35mL/min，进样量2μL；流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和-0.1％甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脱，洗脱梯度如下：

0～2min，95％流动相A，5％流动相B；

2～4min，95％→70％流动相A，5％→30％流动相B；

4～8min，70％→50％流动相A，30％→50％流动相B；

8～10min，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；

10～14min，20％→0％流动相A，80％→100％流动相B；

14～15min，0％流动相A，100％流动相B；

15～15.1min，0％→95％流动相A，100％→5％流动相B；

15.1～16min，95％流动相A，5％流动相B。

质谱条件：ESI电喷雾离子源，分别采用正、负离子模式检测。正离子模式：喷雾电压3.8kV，鞘气流量40arb，辅助气流量10arb；负离子模式：喷雾电压3.0kV，鞘气流量35arb，辅助气流量8arb。毛细管温度为320℃，以70000分辨率进行全扫描，采用高能诱导裂解进行二级裂解，分辨率为17500，扫描范围为m/z 70～1000Da。

2.2数据处理及分析

①UPLC-Q-Exactive MS成分分析：

液质原始数据，经Progenesis QI v2.3软件完成数据转换，包括峰提取、对齐、鉴别及归一化等预处理。基于PMDB(plant metabolome database)数据库进行代谢物定性分析，通过匹配化合物的精确质量数、二级碎片以及同位素分布等信息，对化合物定性结果进行打分，保留综合分数(Score)为36分(满分60分)及以上的结果，合并正离子模式(pos)和负离子模式(neg)数据，得到原始数据矩阵。最终以综合分数和相关文献报道数据，筛选匹配度较高且主要关注类型的化合物，获得数据矩阵，主要包含质荷比(m/z)、保留时间(Retention time)、检测模式(pos/neg)、代谢物名称(Metabolites)、分类(Class)、加合离子(Adducts)、分子式(Formula)、误差(Mass error)、化合物定性综合分数(Score)和二级碎片定性分数(Fragmentation score)等定性结果参数，用于后续分析。

数据库及定性结果打分规则：PMDB数据库(Plant Metabolome Database)，针对植物样本建立的专属代谢物数据库，数据库包含6200+代谢物，其中涵盖生物碱类、酚酸类、黄酮类、香豆素类、苯丙素类、木脂素、萜类等10大类代谢物，除包含代谢物的分类、质量数、碎片离子、保留时间等基础信息外，对于代谢物代谢通路、功能研究和物种来源等生物学信息也均有收录。化合物定性结果打分规则为，综合分数(Score)：满分60分，一级质谱精确分子量匹配(20分)，二级质谱碎片匹配(20分)，同位素分布匹配(20分)，一般情况认为得分越高定性的越准确；二级碎片定性分数(Fragmentation score)：与数据库理论碎片进行匹配，满分100分。

②

代谢组学分析：质谱上机过程中，间隔进QC样本。将完成预处理的数据矩阵，进行PCA、OPLS-DA等多元统计分析。结合变量对分组贡献得分、t检验结果(以P-value值判断差异是否具有显著性)和变异倍数(fold change,FC)分析等，进行组间差异代谢物比较，筛选标准一般为VIP＞1.0、P<0.05。

3结果与分析

3.1不同发育时期牛大力花的UPLC-Q-Exactive MS分析

基于UPLC-Q-Exactive MS技术对不同发育时期牛大力花的代谢物进行分析,液质的基峰图(base peak chromatograms，BPC)如图2A、B所示。按照“2.3”所述UPLC-Q-Exactive MS成分分析方法，通过一级质谱精确分子量、二级质谱碎片和同位素分布信息与数据库进行匹配、打分和筛选，保留＞36分的化合物定性结果。结合文献和前期研究成果，在正、负离子模式下，共鉴定225个化合物，结果如表1(注：响应平均值＞2000标记为“+”，表示鉴定到该成分，响应值＜2000无标记为“-”，表示未鉴定到该成分)所示，分别获得(一)蔓性牛大力花Ⅳ期(凋萎期)、(二)蔓性牛大力花Ⅲ期(盛开期)、(三)蔓性牛大力花Ⅱ期(初花期)、(四)蔓性牛大力花Ⅰ期(花蕾期)、(五)直立性牛大力花Ⅳ期(凋萎期)、(六)直立性牛大力花Ⅲ期(盛开期)、(七)直立性牛大力花Ⅱ期(初花期)、(八)直立性牛大力花Ⅰ期(花蕾期)的检测结果。

表1

/>

/>

/>

/>

/>

/>

3.1.2多元统计分析及差异代谢物的筛选

采用无监督投影法进行PCA分析，观察各样本间的总体分布情况，其中模型累积解释率R

为了明确牛大力花凋萎期(Ⅳ期)和花蕾期、初花期、盛开期(Ⅰ～Ⅲ期)整体之间的差异，将4个时期样本分为两组，进行OPLS-DA分析，该模型主要参数R

整体而言，上述差异成分可分为三大类。在Ⅳ期含量较高的化合物有38个，从乳香酸(Boswellic acid)～五羟黄酮(Tricetin)，并且在2种植株形态间存在一定差异(各时期样本编号中1～3为蔓性花样本，4～6为直立性花样本)。蔓性花中含量较高的主要为原花青素(黄酮类)，直立性花中主要为三萜及其皂苷元。其余41个化合物在I-III期含量较高，主要为异黄酮、黄烷等黄酮及其苷类，在2种形态之间有一定的时期波动，但整体差异不明显。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。