一种酱香型白酒酿造过程中驱动微生物群落演替的“翻堆”工艺及其应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种酱香型白酒酿造过程中驱动微生物群落演替的“翻堆”工艺及其应用。本发明公开的在酱香型白酒的酒醅堆积发酵过程中，“翻堆”可导致位于不同层的酒醅发酵参数(包括酸度和水分含量)重新排布，从而推动微生物群落的演替。微生物群落的连续演替产生的生物热可造成酒醅堆体温度的快速上升。翻堆后，发酵谷物中乙醇、苯乙醇、乙酸、9，12‑十八碳二烯酸正丙酯和9，12‑十八碳二烯酸乙酯的含量增加，而在酸度、温度和乙醇的协同作用下，乳酸杆菌、毕赤酵母和伊萨酵母属的相对丰度显著升高，其中，乳酸杆菌和伊萨酵母属成为优势属，片球菌、曲霉菌、嗜热子囊菌和嗜热丝孢菌属的相对丰度显著降低。本发明为深度解析中国白酒酿造传统发酵工艺背后蕴含的科学问题奠定坚实理论基础，为白酒的实际工业化生产提供重要参考。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种酱香型白酒酿造过程中驱动微生物群落演替的“翻堆”工艺及其应用。

背景技术

酱香型白酒因其酱香浓郁、酒体醇厚、香气持久，而备受中国消费者青睐。酱香型白酒传统酿造工艺是以高粱为原料，小麦制成的高温大曲为发酵剂，历经一年时间，蒸馏获得7个轮次的基酒，将各轮次基酒依一定比例混合勾调，终得酱香型白酒产品。微生物发酵是酱香型白酒传统酿造过程中的关键步骤，可分为堆积发酵和窖池发酵两个阶段。在堆积发酵过程中，发酵谷物与酒曲混合，积成堆型，发酵3-7天。酒曲中丰富的微生物将粮谷原料含有的淀粉和蛋白质水解为还原糖和氨基酸，同时将其转化为乙醇、酸和其它代谢物，为后续的窖池发酵奠定基础。微生物代谢醇和酸等物质的不断积累会显著改变发酵谷物所处的环境条件，促进适应发酵体系的微生物生长，同时不适合发酵体系的微生物的生长受到抑制。此外，在开放环境中进行堆积发酵，会导致环境微生物迁移或分散到发酵谷物中，且与之内源微生物相互作用。由环境条件驱动微生物群落演替产生的大量代谢热，促进发酵谷物的温度快速升高，当酒醅堆体顶部达到一定温度时，发酵谷物将被移至窖池中进行窖池发酵。

酱香型白酒实践生产过程中，为缩短堆积发酵的持续时间，技术人员常采用将已堆积的发酵谷物堆翻动后抖松分散，再拌匀重新建堆的“翻堆”工艺来促进发酵谷物的快速升温，从而加速堆积发酵过程。“翻堆”是指。该工艺可以通过重新分配有机物，导致发酵参数变化，从而影响微生物的代谢和演替。然而，“翻堆”行为对酱香型白酒堆积发酵的影响机制尚未清晰。因此，深入科学解析“翻堆”工艺为理解酱香型白酒传统酿造过程的内在机理提供了理论基础，为白酒高质高效生产及工艺商业化推广发展贡献了重要指导作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酱香型白酒酿造过程中驱动微生物群落演替的“翻堆”工艺及其应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种酱香型白酒酿造过程中驱动微生物群落演替的“翻堆”工艺。

本发明还公开了“翻堆”工艺在白酒酿造中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明利用生物技术，探究酱香型白酒酿造过程中传统“翻堆”工艺蕴藏的科学道理，透彻地揭示“经验式”操作的内在原理。传统“翻堆”可导致位于不同层的酒醅发酵参数(包括酸度和水分含量)重新排布，从而推动微生物群落的演替。微生物群落的连续演替产生的生物热可造成酒醅堆体温度的快速上升。翻堆后，发酵谷物中乙醇、苯乙醇、乙酸、9，12-十八碳二烯酸正丙酯和9，12-十八碳二烯酸乙酯的含量增加，而在酸度、温度和乙醇的协同作用下，乳酸杆菌、毕赤酵母和伊萨酵母属的相对丰度显著升高，其中，乳酸杆菌和伊萨酵母属成为优势属，片球菌、曲霉菌、嗜热子囊菌和嗜热丝孢菌属的相对丰度显著降低。本发明为深度解析中国白酒酿造传统发酵工艺背后蕴含的科学问题奠定坚实理论基础，为白酒的实际工业化生产提供重要参考。

本发明通过解析酱香型白酒酿造过程中的“翻堆”工艺，揭示其驱动微生物群落演替的科学实质，在解析和发展白酒酿造工艺方面具有重要参考价值。

附图说明

图1为酱香型白酒堆积发酵过程中微生物群落β多样性分析图

图2为酱香型白酒堆积发酵过程中不同层位微生物群落结构变化图

图3为酱香型白酒堆积发酵过程中不同层位发酵参数变化图

图4为酱香型白酒堆积发酵过程中不同层位挥发性化合物的时间特征图

图5为酱香型白酒堆积发酵过程中发酵参数和微生物群落之间的相关性分析图

具体实施方式

下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。

实施例1酒醅微生物多样性分析

1.1样品采集

酿造酱香型白酒的酒醅样品均采集于北京华都酿酒食品有限责任公司的工厂车间。酱香型白酒酿造过程中堆积发酵约持续4d，且在48h-66h进行“翻堆”操作。取样的时间点为0h、24h、48h、66h、72h、78h和84h，分别从酒醅堆体表面层、中间层和里芯层收集发酵谷物样品，每层选取三个采样点，将每层的三个样品充分混合制备成待测试样品，取样时温度分别为24.0℃，22.0℃，21.0℃，19.0℃，21.0℃，19.8℃和19.8℃。

1.2酒醅样品DNA的提取与测序分析

提取各酒醅样品的基因组DNA，分别利用引物对338F(5′-ACCTACGGGGGGCAGCAG-3′)、806R(5′-GGATTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和ITS 1(5′-TCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS 2(5′-GCGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对扩增扩增细菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因进行扩增。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行序列测定(上海美吉生物医药科技有限公司)。

用Shannon和Chao 1指数表示的α多样性代表了微生物群落的多样性和丰富度。微生物多样性的数据分析结果表明，与48h相比，66h时酒醅堆体表面层、中间层和里芯层细菌群落的Shannon和Chao1指数下降，而中间层和里芯层真菌群落的Shannon指数以及表面层和里芯层真菌群落的Chao 1指数均降低。Venn图显示，“翻堆”前后样品中细菌群落的OTUs(Operational Taxonomic Unit，分类操作单元)为64，真菌群落的OTUs为42。结果说明，“翻堆”会导致细菌和真菌群落的多样性和丰富度发生变化。β多样性分析结果显示，“翻堆”前后样品中的微生物群落有明显的集群(图1)。

“翻堆”前(0-48h)，Lentibacillus、Oceanobacillus和Kroppenstedtia为优势属(平均相对丰度大于10％)；Lactobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Pediococcus、Thermoactinomyces、Bacillaceae、Sporolactobacillaceae、Ralstonia、Saccharopolyspora、Corynebacterium_1、Weissella、Garciella、Anaerosalibacter、Actinopolysporaceae、Rhodococcus、Burkholderia-Paraburkholderia为次优势属(平均相对丰度在10％至1％之间)(图2)。“翻堆”前位于酒醅堆体外、中、里芯层细菌群落结构相似。Lentibacillus的相对丰度在24h增加至35.0％，在48h恢复至19.4％；与0h相比，在48h时Lactobacillus的相对丰度下降了36.8％。“翻堆”后(66-84h)，酒醅堆体三层中Lactobacillus的平均相对丰度显著增加，并被视为优势属之一，而Lentibacillus和Staphylococcus的平均相对丰富度下降(图2)。此外，酒醅堆体表面层和中间层Lactobacillus的相对丰度高于中间层，表面层和中间层细菌群落的结构和演替模式相似。

真菌群落多样性的检测结果表明，所有样本共含有152个属，其中14个属的相对丰度超过1％，占真菌群落总数的94.31％-97.79％。在“翻堆”前(0-48h)，Byssochlamys、Thermoascus、Thermomyces和Aspergillus为优势属；Issatchenkia、Aspergillus、Monascus、Pichia、Saccharomycetales和Ascomycota为次优势属，酒醅堆体三层真菌群落结构相似。在酒醅堆体的三层中，Issatchenkia的相对丰度从0.2％-0.7％逐渐增加至1.4％-11.1％。

“翻堆”后(66-84h)，酒醅堆体三层中Byssochlamys、Issatchenkia、Pichia和Saccharomycetales的平均相对丰度增加，而Thermoascus、Thermomyces、Monascus、Aspergillus和Ascomycota的平均相对丰度降低。在66h时，酒醅堆体表面层和里芯层中Byssochlamys的相对丰度增加了240.9％-327.1％，而其在中间层中的相对丰度无显著变化。与48h时相比，酒醅堆体表面层和里芯层中的Thermoascus、Thermomyces和Aspergillus的相对丰度降低了14.9％至71.3％，而Issatchenkia的相对丰度增加了133.3％-557.1％。在84h时，酒醅堆体表面层和里芯层中Byssochlamys的相对丰度逐渐降低至5.2％-10.8％。Issatchenkia和Pichia的相对丰度分别达到30.1％-52.3％和5.5％-7.3％，与48h时相比分别增加了271.2％-1016.7％和355.0％-916.7％，Issatchenkia被视为优势属之一，Pichia被定义为次优势属之一(图2)。

实施例2酒醅理化性质分析

酒醅堆体温度是控制堆积发酵过程和确定“翻堆”时间的关键指标之一。堆积发酵过程中酒醅堆体不同层的温度变化如图3所示。在“翻堆”前(0-48h)，酒醅堆体三层温度随时间延长而逐渐降低(图3A)。在48h时，酒醅堆体表面层、中间层和里芯层温度分别为22.3℃、27.7℃和28.7℃。翻“翻堆”后(66-84h)，酒醅堆体中间层和里芯层温度迅速升高，在84h时，表面层、中间层和里芯层的温度分别达到28.2℃、37.8℃和37.4℃(图3A)。研究结果表明，“翻堆”可促进酒醅堆体温度的快速上升。

“翻堆”改变了发酵参数从而影响微生物群落结构。在“翻堆”前(0-48h)，酒醅堆体三层发酵谷物的酸度呈现先升高后降低的趋势。在48h时，里芯层发酵谷物的酸度最低，达到0.82mol/L(图3B)。随着发酵时间延伸，酒醅堆体三层发酵谷物的淀粉含量迅速下降，在48h时达到17.6％-17.7％(图3C)，水分含量在54.4％-56.3％之间波动(图3D)。“翻堆”后(66h)，表面层和里芯层发酵谷物的酸度增加，而中间层的酸性降低(图3B)。酒醅堆体表面层和中间层发酵谷物的水分含量升高，而里芯层的水分含量降低(图3D)。此外，酒醅堆体三层发酵谷物的淀粉含量在66h时急剧下降(图3C)。上述结果表明，“翻堆”会导致酒醅堆体不同位置的发酵参数发生显著变化，且伴随着发酵进行，表面层和里芯层发酵谷物的酸度迅速下降，而三层发酵谷物中的淀粉含量保持稳定(图3B和图3C)，表面层和中间层发酵谷物的水分含量随时间延伸逐渐降低(图3D)。

实施例3酒醅风味物质分析

对“翻堆”前后，酒醅堆体中发酵谷物含有的挥发性物质进行了鉴定和定量分析，共鉴定出41种挥发性物质，包括6种醇、2种醛、5种酸、22种酯和6种其他物质(图4)。主成分分析(PCA)结果表明，“翻堆”前(0-48h)，酒醅堆体表面层和里芯层样本所含风物物质是聚类的，而中间层是离散的。酒醅堆体中间层发酵谷物的苯乙醇、S-乳酸乙酯、9，12-十八碳二烯酸乙酯、油酸乙酯和棕榈酸乙酯含量逐渐降低，而乙醇和9，12-十八碳二烯酸正丙酯的趋势相反。“翻堆”后，乙醇、苯乙醇、乙酸、9，12-十八碳二烯酸正丙酯和9，12-十八碳二烯酸乙酯含量提升(图4)。与48h时相比，72h时酒醅堆体表面层、中间层和里芯层发酵谷物中的乙醇浓度分别增加了930.3％、284.0％和232.4％，研究结果表明，乙醇可能是微生物群落演替潜在的驱动因素(图4)。

实施例4微生物-理化性质-风味物质关联分析

温度、酸度、水分、淀粉和乙醇含量被确定为酱香型白酒发酵过程中微生物群落演替的关键驱动因素。利用RDA分析(Redundancy Analysis，冗余分析)探索上述发酵参数的动态变化与“翻堆”前后发酵谷物微生物群落演替之间的相关性。“翻堆”前，酒醅堆体中细菌和真菌群落结构与酸度、水分和淀粉含量呈正相关(图5A和图5B)，中间层和里芯层细菌群落结构变化与温度和乙醇含量呈正相关，而表面层细菌群落和真菌群落变化与温度和乙醇含量呈负相关(图5A和图5B)。“翻堆”后(66h)，酒醅堆体表面层细菌群落结构变化与酸度、水分、温度、乙醇和淀粉含量呈负相关(图5A)，中间层细菌群落结构变化与酸度和淀粉含量呈负相关，而与乙醇含量呈正相关(图5A)。发酵参数与细菌群落结构之间的相关性随时间延伸而发生显著变化。在84h时，表面层和里芯层细菌群落结构变化与乙醇含量呈正相关，中间层细菌群落结构与所有测试的发酵参数呈正相关(图5A)。

选取堆积发酵过程中相对丰度最高的15个细菌和真菌属，分析其与发酵参数的相关性，以更深入地了解发酵参数动态变化与微生物群落演替之间的关系。

相关性分析结果表明，Ascomycota、Saccharomycetales、Issatchenkia和Pichia的相对丰度与温度呈正相关，而与酸度呈负相关(图5C和图5D)，而Thermoascus和Thermomyces表现出对比相关性(图5D)。此外，Thermoascus、Thermomyces、Staphylococcus、Lentibacillus和Aspergillus与淀粉含量呈正相关，而Byssochlamys与淀粉含量呈负相关。此外，红曲霉属和毕赤酵母属与温度和乙醇含量呈正相关，而葡萄球菌与温度和酒精含量呈负相关(图5C，5D)。