一种鲤LPL1重组蛋白及其制备方法

摘要

本发明提供一种鲤LPL1重组蛋白，并公开了氨基酸序列和核苷酸序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明提供一种包含鲤LPL1重组蛋白基因的质粒。本发明提供一种鲤LPL1重组蛋白的制备方法。本发明采用SlyD或Skp作为重组蛋白的融合标签，可以促进目标蛋白的正确折叠和复性，可以提高目标蛋白的表达量和可溶性。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鲤LPL1重组蛋白及其制备方法。

背景技术

原核表达系统是体外获得大量蛋白，用以研究蛋白结构、功能以及应用于治疗、生产等的首要选择，其中大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、成本低廉、生产率高、操作简单等优点，是常见的原核表达系统。但是大肠杆菌原核表达系统具有以下几个方面的不足：1、由于存在密码子的喜好，很多真核基因在大肠杆菌中不表达；2、大部分外源蛋白以包涵体形式表达；3、表达蛋白纯化难获得。因此，针对以上不足之处，常常采用以下办法：选取合适的表达载体、表达条件优化、密码子优化、融合标签及分子伴侣共表达等方法均能够提高外源蛋白的可溶性。

脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)是一种由脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及乳腺细胞等实质细胞合成和分泌的一种糖蛋白，属于酯酶家族。LPL主要催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白的甘油三酯水解，产生供组织利用的脂肪酸和单酰甘油。LPL能分解卵磷脂、磷脂酰乙醇胺，并促使脂蛋白之间转移胆固醇、磷脂及载脂蛋白，在机体脂质代谢调控上起关键作用。鲤LPL包含3个同源蛋白，LPL1、LPL2、LPL3，分子量分别为56.51kDa、54.85kDa和59.49kDa。为促进鲤脂肪代谢的机制的理论基础研究，对鲤LPL进行体外重组蛋白原核表达及纯化非常必要。但是实际操作中，面临表达效率低、可溶性差、纯化效率低的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种鲤LPL1重组蛋白，氨基酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

进一步的，SEQ ID NO.1对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；SEQ ID NO.2对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

采用SlyD或Skp作为重组蛋白的融合标签；其中：LPL1基因序列如SEQ ID NO.5所示，SlyD基因序列如SEQ ID NO.6所示，Skp基因序列如SEQ ID NO.7所示。LPL1和SlyD之间，LPL1和Skp之间通过碱基序列GAATTC连接，而且实验证实不影响LPL1功能。

对裂解敏感蛋白D(sensitive to lysi s D，SlyD)是一种分子量为28kDa的分子伴侣蛋白，能够促进蛋白的正确折叠，SlyD蛋白的C末端含丰富的组氨酸，能够与Ni

因此，使用SlyD和Skp作为鲤LPL1重组蛋白的融合标签，构建含有SlyD和Skp融合标签的重组质粒，能够提高原核表达重组蛋白的可溶性，而且在后续研究中无需对该融合标签进行切除，减少重组LPL1蛋白酶活性的损失。

进一步的，重组蛋白表达的载体为质粒，进一步的，质粒为改造后的pET43.1a(+)。

本发明提供一种重组质粒，将pET43.1a(+)质粒载体上的NusA-tag、S-tag和HSV-tag替换为SlyD或Skp融合标签。

本发明提供一种包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示所述鲤LPL1重组蛋白基因的质粒，其特征是：将pET43.1a(+)质粒载体上的NusA-tag、S-tag和HSV-tag替换为SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4。

本发明提供一种鲤LPL1重组蛋白的制备方法，其特征是，包含如下步骤：

(4)PCR扩增及扩增片段回收；

(5)重组质粒的构建及测序；

(6)转化，蛋白诱导表达。

进一步的，鲤LPL1重组蛋白的制备方法，其特征是，诱导温度分为20℃和25℃。

本发明提供一种重组质粒的制备方法，其特征是，包含如下步骤：

(5)载体、融合标签基因片段双酶切，切除原质粒载体上的NusA-tag和S-tag片段；

(6)重组质粒pET43.1a-Skp或pET43.1a-SlyD的构建；

(7)重组质粒pET43.1a-Skp或pET43.1a-SlyD及鲤LPL1双酶切，切除原质粒载体上的HSV-tag片段；

(8)pET43.1a-Skp-LPL1或pET43.1a-SlyD-LPL1构建。

本发明的有益效果：

(1)SlyD和Skp没有脂蛋白脂肪酶的生物活性，添加融合标签Skp和SlyD的蛋白表达载体可以提高目标蛋白的表达量和可溶性。

(2)添加融合标签SlyD的蛋白表达载体能起到促进蛋白分离纯化的作用。

(3)切除原质粒载体上的Nus-tag、S-tag和HSV-tag等，使融合蛋白无冗余氨基酸序列，利于后续研究。

(4)获得大量具有活性的鲤LPL1重组蛋白，为其功能研究提供了基础。

(5)对包涵体蛋白的复性发现含有融合标签Skp和SlyD可以促进目标蛋白的正确折叠和复性。

附图说明

图1：pET43.1a-Skp-LPL1或pET43.1a-SlyD-LPL1重组质粒构建流程图。

其中：Amp为氨苄抗性基因；Ori为质粒复制起始位点；LacI为启动子，来自大肠杆菌的乳糖操纵子；NusA-tag能增加融合蛋白的溶解度和表达；S-tag可使用S-tag抗体进行免疫检测，也可用于蛋白质纯化；HSV-tag可用于免疫检测；Nde I、EcoR I、Xho I为酶切位点；6×his Tag为组氨酸标签，用于蛋白纯化。

图2：Skp-LPL1诱导表达。

其中：M：蛋白Marker；1：不加IPTG；2：20℃IPTG总菌；3：20℃IPTG上清；4：25℃IPTG总菌；5：25℃IPTG上清；6：28℃IPTG总菌；7：28℃IPTG上清；8：37℃IPTG总菌；9：37℃IPTG上清。

图3：Skp-LPL1在20℃、25℃、28℃、37℃诱导温度下上清中可溶性重组蛋白占总菌中该蛋白的比率。

图4：SlyD-LPL1表达图。

其中：M：蛋白Marker；1:不加IPTG；2：16℃IPTG总菌；3：16℃IPTG上清；4：16℃IPTG沉淀；5：20℃IPTG总菌；6：20℃IPTG上清；7：20℃IPTG沉淀；8：25℃IPTG总菌；9：25℃IPTG上清；10：25℃IPTG沉淀；11：37℃IPTG总菌；12：37℃IPTG上清；13：37℃IPTG沉淀。

图5：SlyD-LPL1在16℃、20℃、25℃、37℃诱导温度下上清中可溶性重组蛋白占总菌中该蛋白的比率。

图6：可溶性蛋白纯化得及浓度测定

其中：A.纯化后的Skp-LPL1。M：蛋白marker；1～6分别为浓度为5.0μg、10.0μg、15.0μg、20.0μg、25.0μg、30.0μg的BSA蛋白。B.纯化后的SlyD-LPL1。M：蛋白marker；1～6分别为浓度为3.75μg、5.0μg、10.0μg、15.0μg、20.0μg、25.0μg的BSA蛋白。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1：

1.实验试剂：限制性核酸内切酶NcoⅠ，EcoRⅠ和Nde I购自美国NEB公司；2×Phanta-MaxMaster Mix、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自中国Vazyme公司；预染蛋白Mark、5×蛋白质加样缓冲液购自中国生工公司。氨苄青霉素，异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。

2.PCR扩增及扩增片段回收。

slyD基因片段和skp基因片段的扩增：使用primer6.0设计slyD和skp特异性引物，并在slyD正向引物(

LPL1基因片段的扩增：采用正向引物为(

PCR扩增产物均使用浓度为1％左右的琼脂糖凝胶检测，产物纯化回收使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme，中国)。

3.重组质粒的构建及测序

(1)载体、Skp和SlyD基因片段双酶切：选取质粒pET43.1a(+)作为重组蛋白表达的载体。用限制性内切酶Nde I和EcoR I对pET43.1a(+)、Skp和SlyD基因片段进行双酶切，体系为30μL，其中基因片段或者载体为12μL，Nde I和EcoR I各1μL，10×H buffer为3μL，13μLddH

(2)重组质粒pET43.1a-Skp和pET43.1a-SlyD的构建。连接：将上述双酶切回收后的pET43.1a(+)载体分别和Skp、SlyD基因片段进行连接，连接体系为10μL，其中pET43.1a2μL，Skp或SlyD片段3μL，Soultion I 5μL(TaKaRa，日本)，混匀后，于恒温循环槽箱(上海比朗科挤有限公司，中国)中，16℃连接10h左右。转化：将连接产物与30μL大肠杆菌Dh5α感受态细胞混合，冰浴30min后，42℃热击45s，冰浴2min，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床200r/min培养60min。使用离心机5000r/min离心2min，吸走300μL上清，剩余液体吸打均匀，取100μL涂布在含氨苄抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养，选取单菌落，加入含氨苄抗性的1mL LB液体培养基，摇床过夜培养。验证：以菌液为模板，分别用slyD引物对和skp引物对进行PCR检测，并筛选阳性单克隆送测序，测序公司为上海生工。质粒提取：对经测序验证的菌株进行质粒提取，质粒提取试剂盒为FastPure Plasmid Mini Kit(Vazyme，中国)。

(3)重组质粒pET43.1a-Skp和pET43.1a-SlyD及鲤LPL1双酶切：双酶切体系为30μL，其中重组质粒或LPL1基因片段为12μL，限制性内切酶EcoR I和Xho I分别为1μL，10×Hbuffer为3μL，13μL ddH

(4)pET43.1a-Skp-LPL1和pET43.1a-SlyD-LPL1构建：将酶切纯化后的pET43.1a-Skp、pET43.1a-SlyD分别与酶切纯化后的鲤LPL1进行连接。连接、转化、验证及质粒提取步骤同(2)，构建的重组质粒分别命名为pET43.1a-Skp-LPL1和pET43.1a-SlyD-LPL1。连接后，载体上的添加的片段分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

pET43.1a-Skp-LPL1或pET43.1a-SlyD-LPL1重组质粒构建流程图，如图1所示。

4.蛋白诱导表达及纯化

(1)转化：重组质粒pET43.1a-Skp-LPL1和pET43.1a-SlyD-LPL1转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞，1μL质粒和30μL感受态混合，冰浴30min后，42℃水浴热击45s，冰浴2min，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床200r/min培养60min，取100μL涂在含氨苄抗性的LB固体培养基上，37℃培养12h，挑取单克隆菌落接种于10mL含氨苄的LB液体培养基中培养12h。

(2)诱导表达及重组蛋白获取：扩大培养，取1mL前述菌液接种于100mL含氨苄的LB液体培养基，37℃培养2～3h。菌液吸光度OD 600值达到0.6时，加入IPTG(终浓度0.1mM)进行蛋白表达诱导，使用不同的诱导培养温度，时间为12h。将诱导后的菌液4℃，5000rpm离心10min，去上清。加入10mL非变性裂解液(NaH2PO4 50mmol/L，NaCl 300mmol/L，pH8.0)和终浓度为0.1mg/mL蛋白酶抑制剂(PMSF)，使用超声波细胞破碎仪(南京舜玛)对菌液进行破碎，4℃，12000rpm离心5min，留上清液。取10μL上清，加入2.5μL 5×蛋白上样缓冲液(250mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，7.5％DTT)，吹打混匀后，100℃水浴锅20min。取10μL用12％SDS-PAGE凝胶进行电泳分析，考马斯亮蓝R-250染色1h显示电泳结果。通过Image Lab

(3)可溶性重组蛋白的纯化：选择20℃和25℃的诱导温度分别诱导Skp-LPL1、SlyD-LPL1重组蛋白，180r/min摇床12h，离心收集菌，加入非变性裂解液、蛋白酶抑制剂超声，离心后取上清，用0.22μm滤膜过滤，使用碧云天镍柱纯化柱纯化目的蛋白，用BSA标准蛋白确定浓度。

5.结果分析

(1)诱导表达获得的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。在上清中均获得Skp-LPL1和SlyD-LPL1重组蛋白，说明Skp-和SlyD-融合标签有效促进重组蛋白的可溶性。所获得Skp-LPL1和SlyD-LPL1重组蛋白的分子量分别是72.46kDa和77.62kDa(图2和图4)。不同温度诱导蛋白表达结果灰度分析显示，Skp-LPL1在20℃、25℃、28℃、37℃诱导温度下上清中可溶性重组蛋白占总菌中该蛋白的比率分别是62％、54％、43％和26％(图3)。SlyD-LPL1在16℃、20℃、25℃、37℃诱导温度下上清中可溶性重组蛋白占总菌中该蛋白的比率分别是74％、51％、89％和22％(图5)。因此，Skp-LPL1和SlyD-LPL1可溶性重组蛋白得量最高的最适诱导温度分别为20℃和25℃。最适温度下，上清中Skp-LPL1和SlyD-LPL1在总融合蛋白中占的比例分别为62％和89％，可见融合标签Skp-和SlyD-均能促进可溶性蛋白的表达，而且含SlyD-的重组蛋白较含有Skp-的具有更好的可溶性效果。

(2)结果显示：可溶性Skp-LL1和SlyD-LPL1重组蛋白均可经纯化获得纯化蛋白，每获得1g总菌获得可溶性Skp-LL1和SlyD-LPL1重组蛋白的质量为分别为0.24mg和0.31mg(图6)。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 一种鲤LPL1重组蛋白及其制备方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 631

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu Phe Gln Gln Val

1 5 10 15

Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Arg Ala Ser Glu Leu Gln Arg Met Glu Thr Asp Leu Gln Ala Lys Met

35 40 45

Lys Lys Leu Gln Ser Met Lys Ala Gly Ser Asp Arg Thr Lys Leu Glu

50 55 60

Lys Asp Val Met Ala Gln Arg Gln Thr Phe Ala Gln Lys Ala Gln Ala

65 70 75 80

Phe Glu Gln Asp Arg Ala Arg Arg Ser Asn Glu Glu Arg Gly Lys Leu

85 90 95

Val Thr Arg Ile Gln Thr Ala Val Lys Ser Val Ala Asn Ser Gln Asp

100 105 110

Ile Asp Leu Val Val Asp Ala Asn Ala Val Ala Tyr Asn Ser Ser Asp

115 120 125

Val Lys Asp Ile Thr Ala Asp Val Leu Lys Gln Val Lys Glu Phe Ala

130 135 140

Thr Ser Ile Glu Pro Ala Ser Glu Phe Pro Thr Phe Asn Asn Ile Met

145 150 155 160

Asp Asn Gly Thr Glu Trp Met Thr Asp Phe Ser Asp Ile Val Ser Lys

165 170 175

Phe Ser Phe Arg Thr Ser Glu Glu Pro Glu Asp Asp Leu Cys Tyr Ile

180 185 190

Val Pro Gly Gln Pro Glu Thr Ile Lys Glu Cys Asn Phe Asn Pro Asp

195 200 205

Asn Lys Thr Phe Ile Val Ile His Gly Trp Thr Val Thr Gly Met Phe

210 215 220

Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val Thr Ala Leu Tyr Glu Arg Glu Pro

225 230 235 240

Thr Ala Asn Val Ile Val Val Asp Trp Leu Ser Arg Ala Gln Gln His

245 250 255

Tyr Leu Thr Ser Ala Gly Tyr Thr Lys Leu Val Gly Arg Asp Val Ala

260 265 270

Lys Phe Val Asn Trp Leu Gln Ala Glu Ile Asp Tyr Pro Trp Glu Arg

275 280 285

Leu His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly Ile Ala

290 295 300

Gly Leu Leu Thr Lys His Lys Val Asn Arg Ile Thr Gly Met Asp Pro

305 310 315 320

Ala Gly Pro Ser Phe Glu Tyr Ala Asp Ala Gln Ser Thr Leu Ser Pro

325 330 335

Asp Asp Ala Leu Phe Val Asp Val Leu His Thr Asn Thr Arg Gly Ser

340 345 350

Pro Asp Arg Ser Ile Gly Ile Gln Arg Pro Val Gly His Ile Asp Ile

355 360 365

Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln Pro Gly Cys Asp Leu Gln Asn Thr

370 375 380

Val Leu Met Val Ala Thr Ser Gly Leu Arg Asn Met Asp Gln Ile Val

385 390 395 400

Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile His Leu Phe Ile Asp Ser Leu Val

405 410 415

Asn Gln Asp Gln Glu Ser Met Ala Tyr Arg Cys Ser Ser Lys Asp Ser

420 425 430

Phe Asn Lys Gly Met Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Lys

435 440 445

Val Gly Tyr Gly Val Asn Lys Ile Arg Thr Arg Arg Ser Ser Lys Met

450 455 460

Tyr Met Lys Thr Arg Asn Val Met Pro Tyr Lys Val Phe His Tyr Gln

465 470 475 480

Val Lys Val His Phe Phe Gly Lys Thr Lys Leu Ser Tyr Thr Asp Gln

485 490 495

Pro Ile Lys Ile Ser Leu Tyr Gly Ile His Gly Glu Lys Glu Asn Ile

500 505 510

Pro Tyr Ile Leu Pro Ala Leu Asn Thr Asn Thr Thr Val Ser Phe Leu

515 520 525

Leu Thr Thr Asp Thr Asp Ile Gly Glu Leu Leu Met Val Lys Leu Leu

530 535 540

Trp Glu Lys Asp Thr Leu Ile Ser Trp Pro Trp Trp Asn Pro Asp Thr

545 550 555 560

Phe His Ile Arg Lys Leu Arg Ile Lys Ser Gly Glu Arg Gln Ser Lys

565 570 575

Ile Ile Phe Ser Ala Lys Glu Gly Glu Phe Ser Tyr Leu Ser Arg Gly

580 585 590

Gly Glu Ala Ala Val Phe Val Lys Glu Lys Glu Ala Gln Ser Ser Arg

595 600 605

Lys Asn Gln Arg Leu His Lys Leu Lys Met His Gly Ser Ser Phe Lys

610 615 620

Gln Ser Thr Glu Ser Glu Gln

625 630

<210> 2

<211> 682

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gln Val Arg Thr

1 5 10 15

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20 25 30

Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu Ile Ser Gly Leu Glu Thr Ala Leu

35 40 45

Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala Asn

50 55 60

Asp Ala Tyr Gly Gln Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gln Arg Val Pro Lys

65 70 75 80

Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly Met Arg Phe Leu

85 90 95

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100 105 110

Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gln Asn

115 120 125

Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala Ile Arg Glu Ala Thr Glu Glu

130 135 140

Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His Asp

145 150 155 160

His Asp His Asp Gly Cys Cys Gly Gly His Gly His Asp His Gly His

165 170 175

Glu His Gly Gly Glu Gly Cys Cys Gly Gly Lys Gly Asn Gly Gly Cys

180 185 190

Gly Cys His Glu Phe Ala Thr Ser Ile Glu Pro Ala Ser Glu Phe Pro

195 200 205

Thr Phe Asn Asn Ile Met Asp Asn Gly Thr Glu Trp Met Thr Asp Phe

210 215 220

Ser Asp Ile Val Ser Lys Phe Ser Phe Arg Thr Ser Glu Glu Pro Glu

225 230 235 240

Asp Asp Leu Cys Tyr Ile Val Pro Gly Gln Pro Glu Thr Ile Lys Glu

245 250 255

Cys Asn Phe Asn Pro Asp Asn Lys Thr Phe Ile Val Ile His Gly Trp

260 265 270

Thr Val Thr Gly Met Phe Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val Thr Ala

275 280 285

Leu Tyr Glu Arg Glu Pro Thr Ala Asn Val Ile Val Val Asp Trp Leu

290 295 300

Ser Arg Ala Gln Gln His Tyr Leu Thr Ser Ala Gly Tyr Thr Lys Leu

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Val Gly Arg Asp Val Ala Lys Phe Val Asn Trp Leu Gln Ala Glu Ile

325 330 335

Asp Tyr Pro Trp Glu Arg Leu His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly Ala

340 345 350

His Val Ala Gly Ile Ala Gly Leu Leu Thr Lys His Lys Val Asn Arg

355 360 365

Ile Thr Gly Met Asp Pro Ala Gly Pro Ser Phe Glu Tyr Ala Asp Ala

370 375 380

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Val Gly His Ile Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln Pro Gly

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Cys Asp Leu Gln Asn Thr Val Leu Met Val Ala Thr Ser Gly Leu Arg

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Asn Met Asp Gln Ile Val Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile His Leu

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Phe Ile Asp Ser Leu Val Asn Gln Asp Gln Glu Ser Met Ala Tyr Arg

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Arg Arg Ser Ser Lys Met Tyr Met Lys Thr Arg Asn Val Met Pro Tyr

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Lys Val Phe His Tyr Gln Val Lys Val His Phe Phe Gly Lys Thr Lys

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Leu Ser Tyr Thr Asp Gln Pro Ile Lys Ile Ser Leu Tyr Gly Ile His

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Gly Glu Lys Glu Asn Ile Pro Tyr Ile Leu Pro Ala Leu Asn Thr Asn

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Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Thr Thr Asp Thr Asp Ile Gly Glu Leu

580 585 590

Leu Met Val Lys Leu Leu Trp Glu Lys Asp Thr Leu Ile Ser Trp Pro

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Trp Trp Asn Pro Asp Thr Phe His Ile Arg Lys Leu Arg Ile Lys Ser

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Gly Glu Arg Gln Ser Lys Ile Ile Phe Ser Ala Lys Glu Gly Glu Phe

625 630 635 640

Ser Tyr Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ala Ala Val Phe Val Lys Glu Lys

645 650 655

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His Gly Ser Ser Phe Lys Gln Ser Thr Glu

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<210> 3

<211> 1884

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgacaaaa ttgcaatcgt caacatgggc agcctgttcc agcaggtagc gcagaaaacc 60

ggtgtttcta acacgctgga aaatgagttc aaaggccgtg ccagcgaact gcagcgtatg 120

gaaaccgatc tgcaggctaa aatgaaaaag ctgcagtcca tgaaagcggg cagcgatcgc 180

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tttgagcagg atcgcgcacg tcgttccaat gaagaacgcg gcaaactggt tactcgtatc 300

cagactgctg tgaaatccgt tgccaacagc caggatatcg atctggttgt tgatgcaaac 360

gccgttgctt acaacagcag cgatgtaaaa gacatcactg ccgacgtact gaaacaggtt 420

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aaagaatgta acttcaatcc agataacaag actttcatag ttattcatgg atggacggtt 660

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agcagcaaga tgtacatgaa gaccagaaat gtgatgccat ataaagtttt ccattatcaa 1440

gttaaggtcc acttcttcgg caagacaaaa ttaagctaca ctgatcagcc cattaagatc 1500

tcactgtacg gaatccatgg cgagaaggaa aatatcccct acattttgcc tgctttgaac 1560

acaaacacca ccgtgtcttt cctgctgacc acggacacag acatcggaga gctgctgatg 1620

gtaaaacttc tctgggagaa agacaccctc atcagctggc catggtggaa ccccgatacc 1680

ttccacatcc gcaaactgcg catcaaatca ggagaaagac agtccaagat catcttcagt 1740

gccaaagaag gtgaattttc ctacctttcc cgtggagggg aggccgccgt ctttgtgaaa 1800

gaaaaagaag cccagtcaag ccgcaaaaac cagagattgc acaagttgaa gatgcatgga 1860

agttcattca aacagagcac cgag 1884

<210> 4

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaagtagcaa aagacctggt ggtcagcctg gcctatcagg tacgtacaga agacggtgtg 60

ttggttgatg agtctccggt gagtgcgccg ctggactacc tgcatggtca cggttccctg 120

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gttcttcaca ccaacactcg cggttctcca gatcgcagca ttgggattca gaggccagtg 660

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gcttaccgct gcagctccaa agacagcttc aataagggca tgtgtctcag ctgccgcaag 900

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gacgtattta tgggcgttga tgaactgcag gtaggtatgc gtttcctggc tgaaaccgac 300

cagggtccgg taccggttga aatcactgcg gttgaagacg atcacgtcgt ggttgatggt 360

aaccacatgc tggccggtca gaacctgaaa ttcaacgttg aagttgtggc gattcgcgaa 420

gcgactgaag aagaactggc tcatggtcac gttcacggcg cgcacgatca ccaccacgat 480

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