鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25蛋白单克隆抗体的制备和鲤TRIM25基因的克隆与序列分析

摘要

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2)，是一种感染鲫（Carassiusauratus）、金鱼（Carassius auratus）、及鲤与金鱼杂交体的高致病性病毒，CyHV-2首次发病是在日本养殖的金鱼中;2011、2012年，Wang等首次报道了CyHV-2可感染养殖鲫，造成了我国异育银鲫（Carassius auratusgibelio）的大规模死亡。2013年，武汉、广州、江苏等地也报道了该病的暴发，自发病异育银鲫中检测到CyHV-2。目前控制该病仍缺乏有效的药物和方法，因此，迫切需要研制并建立ELISA等免疫学快速检测方法，为该病的临床诊断及检测提供有效工具。
　　本研究通过克隆CyHV-2具有良好抗原特性的膜蛋白ORF25基因部分片段，并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG上，成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后，SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达，分子量大小为42 KDa，且主要表达在包涵体中。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，多次免疫后通过细胞融合，筛选出一株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western Blot试验验证，这株单抗可以特异性的识别CyHV-2ORF25蛋白。本实验通过制备CyHV-2ORF25蛋白的单克隆抗体，为研究CyHV-2的致病机理及检测方法的建立奠定了基础。
　　为了克隆和表达鲤TRIM25，本研究提取鲤卵巢组织总RNA，以反转录获得的cDNA为模版，通过PCR方法扩增了TIRM25编码区全长，序列分析发现，鲤TRIM25与斑马鱼及朝鲜鳑皱的氨基酸同源性较高，遗传进化分析也聚为一支;进一步将其克隆至真核表达载体pCDNA4.0中，构建了重组质粒pCDNA4-TRIM25，将该重组质粒分别转染HEK293T细胞与FHM细胞，经间接免疫荧光、Western Blot检测，证明TRIM25蛋白在HEK293T细胞和FHM细胞中获得表达。该研究为鲤TRIM25的功能研究奠定了基础。

目录

声明

缩略语表(Abbreviation)

摘要

第一章 文献综述

1 鲤疱疹病毒Ⅱ型的研究现状与进展

1．1 鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒简述

1．2 鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒国内外流行现状

1．3 鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒临床症状与病理特征

1．4 鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒检测方法研究进展

2 单克隆抗体技术

2．1 单克隆抗体技术概述

2．2 单克隆抗体技术的原理

2．3 单克隆抗体技术应用于水产养殖

3 TRIM蛋白家族综述

3．1 TRIM蛋白家族简介

3．2 TRIM蛋白家族结构特点

3．3 TRIM蛋白家族抗病毒功能及研究进展

4 研究目的和意义

第二章 鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25蛋白单克隆抗体的制备

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 目的片段的PCR扩增

2．2 ORF 25菌落PCR检测

2．3 融合蛋白原核表达

2．4 小鼠免疫后血清效价测定

2．5 细胞融合后阳性杂交瘤细胞筛选

2．6 ORF 25单克隆抗体间接免疫荧光鉴定

2．7 ORF 25单克隆抗体免疫印迹分析

3 讨论

第三章 鲤TRIM25基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1．1 实验材料与试剂

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 TRIM25目的基因扩增

2．2 TRIM25重组质粒酶切鉴定

2．3 TRIM25序列分析

2．4 TRIM25系统进化树分析

2．5 间接免疫荧光检测TRIM25蛋白在HEK293T细胞表达

2．6 免疫印迹鉴定TRIM25蛋白在HEK293T细胞表达

2．7 免疫印迹鉴定TRIM25蛋白在FHM细胞表达

3 讨论

参考文献

个人资料

教育经历

在读期间发表的主要文章

致谢