一种抗组织因子单链抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种抗组织因子单链抗体及其制备方法和应用。所述抗组织因子单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示。本发明筛选得到具备高亲和力的抗组织因子单链抗体，所述抗组织因子单链抗体能够高效和组织因子结合，使用竞争Elisa检测亲和力达到10E‑9～10E‑8M，所述抗组织因子单链抗体能够阻断组织因子与其配体或受体的结合，进而阻断组织因子在多种病理过程中发挥作用，具备良好的成药性潜力。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种抗组织因子单链抗体及其制备方法和应用。

背景技术

组织因子(Tissue factor，TF)，又名CD142、凝血因子III(Coagulation FactorIII)、促凝血酶原激酶(thromboplastin)、凝血因子辅酶，是一种进化保守的糖蛋白。TF在不同的物种如人类、小白鼠、鼠、鱼、果蝇和蚊等均有表达。TF自然状态下为两种亚型：全长TF(Full length TF，flTF)和选择性剪切型TF(Alternatively spliced TF，asTF)。

flTF是完整的跨膜蛋白，其中N氨基末端1～219个氨基酸残基位于细胞膜外，涉及与因子VIIa复合物的形成；跨膜域为220～242位氨基酸，锚定于细胞膜，与磷脂紧密结合；胞质内的C端区为243～263位氨基酸，参与信号转导。

asTF含有206个氨基酸，其中1～166位氨基酸与flTF中完全相同，167～206位氨基酸为特异性C端，其缺乏跨膜区，具可溶性，可分泌入循环系统。as TF表达于肿瘤细胞系HL-60、U343、KATOIII、SNU-5、MKN-74、HCT116、A431、WM1341B及WM983A，提示其在肿瘤生物行为中具有重要意义。

TF在多种肿瘤细胞中高表达，包括胃肠癌、泌尿生殖系统癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌和乳腺癌。TF参与凝血过程，其中flTF促进凝血：参与外源性凝血途径，当发生血管损伤，内皮细胞被破坏时，flTF与凝血酶原FVII结合，活化为FVIIa并形成TF-FVIIa复合物，继而激活FIX及FX，触发级联反应，导致纤维蛋白沉积并激活血小板，而asTF促凝血活性极低。同时TF与冠状动脉粥样硬化相关，asTF与flTF在自发形成的动脉血栓和动脉粥样硬化病变处均可检测到，flTF与asTF沉积于富脂质中心，提示与斑块的不稳定性相关。动脉粥样硬化(AS)伴随血管内皮细胞被破坏，导致局部TF表达升高。单核细胞浸润促进斑块不稳定导致斑块破裂，引起斑块内TF与循环内FVIIa接触引发血栓形成，导致心肌梗塞和中风。

TF参与肿瘤的发生和发展，能促进肿瘤细胞增殖。TF/FVIIa复合物能激活PAR2，导致AP-1/PKCα磷酸化，促进ERK1/2和NF-κB磷酸化，激活PI3K和MAPK信号通路；TF可以在肿瘤微环境中调节免疫反应，逃避宿主免疫细胞攻击，促进肿瘤生长；asTF与整合素β1结合直接激活PI3K与MAPK途径。TF还能促进肿瘤细胞转移，其中TF/FVIIa/FXa复合物激活凝血酶，激活血小板并产生纤维蛋白。激活的血小板和纤维蛋白抑制NK细胞功能，吸引单核/巨噬细胞，帮助转移和肿瘤存活。TF也能促进(肿瘤)血管生成，促进VEGF释放，促进血管新生。TF通过与FVIIa结合后，激活凝血酶，增加纤维蛋白，利于内皮细胞有丝分裂并促进其移行；同时激活MAPK或PKC途径影响微血管形成。asTF与整合素结合调节内皮细胞的粘附和定位，增强内皮的毛细血管的形成，增强动脉的生芽作用。因此阻断TF抗原与配体或受体的结合，可以抑制肿瘤的增殖。

综上所述，开发组织因子抗体对于与组织因子相关疾病领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种抗组织因子单链抗体及其制备方法和应用，所述抗组织因子单链抗体对组织因子具有高亲和力，且能够有效阻断组织因子与其配体或受体的结合，进而阻断其在多种病理过程中发挥作用，对于开发治疗组织因子参与的疾病的药物具有重要意义。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗组织因子单链抗体，所述抗组织因子单链抗体的重链的CRD1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，轻链的CRD1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；

或者，所述抗组织因子单链抗体的重链的CRD1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，轻链的CRD1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

本发明中，基于人血液PBMC的抗体可变区基因(VH、Vκ、Vλ)的分布频率和数据库中对应的可变区基因序列，构建全人源噬菌体抗体库，使用标准化固相淘筛流程，筛选得到具备高亲和力的抗组织因子单链抗体，所述抗组织因子单链抗体能够高效和组织因子结合，阻断组织因子与其配体或受体的结合，进而阻断组织因子在多种病理过程中发挥作用，具备良好的成药性潜力。

优选地，所述抗组织因子单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

优选地，所述抗组织因子单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

优选地，所述抗组织因子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

优选地，所述抗组织因子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

SEQ ID NO.1：NNNVAWN。

SEQ ID NO.2：RTYQRSKWYHDYATSVKG。

SEQ ID NO.3：AGGCPMDV。

SEQ ID NO.4：QASENIYNYLS。

SEQ ID NO.5：QASTLAS。

SEQ ID NO.6：QGNDGTGKNIP。

SEQ ID NO.7：RSSQSLLHSNGYNYLD。

SEQ ID NO.8：LGSNRAS。

SEQ ID NO.9：MQALQTPLIT。

SEQ ID NO.10：SYGMH。

SEQ ID NO.11：VISYDGSNKYYADSVKG。

SEQ ID NO.12：TPSYTSWAFDY。

SEQ ID NO.13：

QVQLQQSGPGLVKSSQTLSLTCAISGDSVSNNNVAWNWIRRSPSRGLEWLGRTYQRSKWYHDYATSVKGRISIYPDTSQNHSSPRCELAGGCPMDVWGQGTTVTVSS。

SEQ ID NO.14：

DIVLTQSPASVSEPVGGTVTIKCQASENIYNYLSWYQQKPGQRPKRLIYQASTLASGVPSRFEGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQGNDGTGKNIPFGGGTKVDIK。

SEQ ID NO.15：

QITLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTPSYTSWAFDYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID NO.16：

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLITFGQGTRLEIK。

SEQ ID NO.17：

DIVLTQSPASVSEPVGGTVTIKCQASENIYNYLSWYQQKPGQRPKRLIYQASTLASGVPSRFEGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQGNDGTGKNIPFGGGTKVDIKGGSSRSSSSGGGGSGGGGQVQLQQSGPGLVKSSQTLSLTCAISGDSVSNNNVAWNWIRRSPSRGLEWLGRTYQRSKWYHDYATSVKGRISIYPDTSQNHSSPRCELAGGCPMDVWGQGTTVTVSS。

SEQ ID NO.18：

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLITFGQGTRLEIKGGSSRSSSSGGGGSGGGGQITLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTPSYTSWAFDYWGQGTLVTVSS。

第二方面，本发明提供一种第一方面所述的抗组织因子单链抗体的制备方法，所述方法包括：

将编码第一方面所述的抗组织因子单链抗体的核酸序列插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞并进行培养，分离纯化，得到所述抗组织因子单链抗体。

第三方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子含有编码第一方面所述的抗组织因子单链抗体的核酸序列。

第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第三方面所述的核酸分子。

第五方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的核酸分子。

第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗组织因子单链抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物还包括辅料。

优选地，所述辅料包括药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

第七方面，本发明提供第一方面所述的抗组织因子单链抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的药物组合物在制备治疗组织因子参与的疾病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

(1)本发明筛选得到具备高亲和力的抗组织因子单链抗体，所述抗组织因子单链抗体能够高效和组织因子结合，使用竞争Elisa检测亲和力达到10E-9～10E-8M；

(2)本发明的抗组织因子单链抗体能够阻断组织因子与其配体或受体的结合，进而阻断组织因子在多种病理过程中发挥作用，如阻断组织因子参与促进凝血因子(FX)转化为活化凝血因子(FXa)，具备良好的成药性潜力。

附图说明

图1为本发明制备的CD142抗原的亲和力检测结果图；

图2为噬菌体文库的phage ELISA结果图；

图3为本发明抗组织因子单链抗体亲和力检测结果图；

图4为本发明抗组织因子单链抗体阻断实验结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例设计噬菌体文库引物。

根据人血液PBMC的抗体可变区基因(VH、Vκ、Vλ)的分布频率和IMGT、vbase数据库中对应的可变区基因序列，设计PCR扩增引物，扩增引物的Oligo信息如表1所示。

表1

实施例2

本实施例进行VH、Vκ、Vλ扩增及连接载体。

以10支PBMC为一组，进行RNA提取，约10E+7cells一组，检测RNA浓度，使RNA总量大于10μg/组，并进行反转录，得到cDNA，将各组引物混合，成组进行PCR，并对PCR产物进行切胶回收，使用GA连接体系对pCANTAB-5E载体和PCR产物进行连接，每100μL体系中，载体与片段比例为1:3，体系除盐回收得到30μL连接产物。

实施例3

本实施例构建噬菌体文库。

使用SR320/HP超级感受态细菌，每30μL连接体系电转50μL超级感受态细菌，电转条件：2500V，25μF，200Ω，2mm，50μL/杯，电转后立即加入15mL预热的SOC，复苏1h，取50μL稀释涂布平板，37℃过夜培养，同时放大过夜培养(220rpm，37℃)。

过夜培养的菌液10000×g离心10min，取上清加入1/4体积的20％PEG8000(2.5MNaCl)，终浓度5％，沉淀噬菌体大于20min，12000×g离心20min收集噬菌体，用含10％甘油PBS复溶噬菌体，得到噬菌体文库，-20℃保存。

平板计数统计库容可达到10E+9cfu，转化效率达10E+8cfu/μg DNA，平板测序分析正确插入比例达到90％，测序分析数据如表2所示。

表2

实施例4

本实施例根据数据库中组织因子(CD142)天然抗原的氨基酸序列(如SEQ IDNO.19所示)合成编码基因序列，并插入表达载体pcDNA3.4，进行293细胞瞬时转染和抗原表达，经proteinA纯化得到CD142抗原，纯度达95％，使用结合Elisa方法进行抗原结合能力检测，结果如图1所示，坐标为OD450，横坐标表示样品浓度μg/mL，图中组1为商业化抗原，组2和3为自制抗原，C值即为EC50，表明本实施例获得的CD142抗原与商业化CD142抗体(sinobiological13133-MM05)结合能力与商业化CD142抗原相当(Acro TF3-H52H5)。

SEQ ID NO.19：

SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECM GQEKGEFRE。

实施例5

本实施例进行固相淘筛。

使用PBS将实施例4纯化的抗原稀释为5μg/mL，取100μL包被在96孔板，4℃过夜包被，去掉包被缓冲液，使用封闭液(1％BSA)于37℃进行封闭2h，加入文库，每孔100μL实施例3制备的噬菌体文库，结合2h，洗涤孔板，使用HCL洗脱12min，中和洗脱液，加入1mL OD

实施例6

本实施例进行phage ELISA。

将实施例4纯化的抗原稀释至1μg/mL，按100μL/孔包被，4℃过夜，封闭后，加入80μL过夜培养的阳性克隆菌液上清，结合后洗去上清，加入二抗，孵育1小时，显色后检测OD

选择phage ELISA结果中数值最高的5株单克隆(4#/6#/7#/43#/44#)进行测序，5株单克隆测序后，获得2条抗组织因子单链抗体7#(SEQ ID NO.17)和43#(SEQ ID NO.18)。

实施例7

本实施例检测实施例6筛选得到抗组织因子单链抗体7#和43#的亲和力。

选择IgG1-kappa恒定区分别与抗体7#和43#组合形成完整抗体，以便于进行测试，委托百英生物进行合成，并检测抗体与人源CD142亲和力，检测方法为竞争Elisa，亲和力检测结果图3所示，图中纵坐标为OD

实施例8

本实施例检测实施例7合成的2个完整抗体的抑制作用，采用Elisa抗体滴定法进行检测，在相同的新鲜铺板的MDA-MB-231细胞中加入不同浓度(1/5/10/50/100nM(nmol/L))的待检抗体7#、43#，control+为阳性抗体sino biological 13133-MM05，control-为空白对照(不添加任何抗体)，孵育2h后检测FXa浓度，结果如图4所示，MDA-MB-231细胞表面fvia依赖的FX转化为FXa，FX转化为FXa的百分比(％FXa)与本发明制备抗体的浓度存在相负关性，实验结果表明本发明筛选得到的两条抗组织因子抗体能够有效抑制FXa形成。

综上所述，本发明根据人血液PBMC的抗体可变区基因(VH、Vκ、Vλ)的分布频率和数据库中对应的可变区基因序列，构建全人源噬菌体抗体库，筛选得到具备高亲和力的抗组织因子单链抗体，所述抗组织因子单链抗体能够高效和组织因子结合，使用竞争Elisa检测亲和力达到10E-9～10E-8M，所述抗组织因子单链抗体能够阻断组织因子与其配体或受体的结合，进而阻断组织因子在多种病理过程中发挥作用，如阻断组织因子参与促进凝血因子(FX)转化为活化凝血因子(FXa)，具备良好的成药性潜力。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 天士力生物医药股份有限公司

<120> 一种抗组织因子单链抗体及其制备方法和应用

<130> 2022-04-07

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Asn Asn Val Ala Trp Asn

1 5

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Arg Thr Tyr Gln Arg Ser Lys Trp Tyr His Asp Tyr Ala Thr Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Gly Gly Cys Pro Met Asp Val

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gln Gly Asn Asp Gly Thr Gly Lys Asn Ile Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Ile Thr

1 5 10

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Thr Pro Ser Tyr Thr Ser Trp Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Asn Asn

20 25 30

Asn Val Ala Trp Asn Trp Ile Arg Arg Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Gln Arg Ser Lys Trp Tyr His Asp Tyr Ala

50 55 60

Thr Ser Val Lys Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Pro Asp Thr Ser Gln Asn

65 70 75 80

His Ser Ser Pro Arg Cys Glu Leu Ala Gly Gly Cys Pro Met Asp Val

85 90 95

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 14

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Glu Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Asp Gly Thr Gly Lys

85 90 95

Asn Ile Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Pro Ser Tyr Thr Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 17

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Glu Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Asp Gly Thr Gly Lys

85 90 95

Asn Ile Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Gly Ser

100 105 110

Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln

115 120 125

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln Thr

130 135 140

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Asn Asn Asn

145 150 155 160

Val Ala Trp Asn Trp Ile Arg Arg Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Leu Gly Arg Thr Tyr Gln Arg Ser Lys Trp Tyr His Asp Tyr Ala Thr

180 185 190

Ser Val Lys Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Pro Asp Thr Ser Gln Asn His

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Cys Glu Leu Ala Gly Gly Cys Pro Met Asp Val Trp

210 215 220

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230

<210> 18

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

145 150 155 160

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala

180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Pro Ser Tyr Thr Ser Trp Ala Phe Asp Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 19

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser

1 5 10 15

Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

20 25 30

Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

35 40 45

Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

50 55 60

Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala

65 70 75 80

Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

85 90 95

Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

100 105 110

Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

115 120 125

Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg

130 135 140

Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser

145 150 155 160

Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

165 170 175

Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

180 185 190

Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

195 200 205

Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu

210 215