基于杂交瘤细胞单链抗体制备技术的应用-抗GPV-NS1和GoIFN-γ单链抗体的构建

摘要

单链抗体(single chain variable fragment，ScFv)是通过基因工程方法将抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因通过肽连接物首尾拼接而成的重组蛋白，它是具有抗原结合活性的最小抗体片段，其具有分子量小，对相应抗原具有较强的亲和力和特异性，能通过基因工程技术大量生产等特点。此外，相对于单克隆抗体，单链抗体具有易保存的优势。单链抗体制备的关键是可变区基因的获得，最常用的方法是从分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增抗体可变区基因，然后进行拼接获得单链抗体基因。本研究尝试对实验室制备和保存的两株单克隆抗体进行单链抗体的构建。
　　 首先从分泌抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体和抗鹅IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，采用OligodT为逆转录引物合成cDNA第一链，然后通过重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)PCR引物，扩增出抗体可变区基因片段，并将VH和VL基因克隆到pMD18-T载体中进行测序。其次通过重叠延伸拼接法，在VH下游和VL上游间引入连接肽编码序列(Gly4Ser)3，分别拼接成GPV-NS1-ScFv基因和GoIFN-γ-ScFv基因，序列分析后将ScFv基因分别重组进原核表达载体pET-32a和pET-30a-EAP中，鉴定后转化至感受态菌Rosetta(DE3)pLysS中，经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳分析，重组蛋白以包涵体形式表达，表达的重组融合蛋白大小为46Ku和80Ku左右；抽提包涵体蛋白，经纯化得到较纯的目的蛋白，通过PBS梯度透析法对GPV-NS1-ScFv蛋白和Tris-Hcl梯度透析法对GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白进行复性，并且分别采用间接ELISA法对GPV-NS1-ScFv的抗原性和直接ELISA法对GoIFN-γ-ScFv的抗原性进行分析。
　　 本研究成功地扩增出两种单抗的可变区基因，其中GPV-NS1蛋白单抗VL基因片段324bp，VH基因片段354bp；GoIFN-γ单抗VL基因片段342bp，VH基因片段357bp。SOE-PCR法拼接出的GPV-NS1-ScFv基因片段为741bp；GoIFN-γ-ScFv基因片段为762bp。并获得两种ScFv基因的重组表达载体，实现其在大肠杆菌中的表达。蛋白大小与预期一致，并对表达的蛋白质进行了纯化和复性，最终获得了能够与鹅细小病毒NS1蛋白单抗和鹅γ-干扰素单抗相关抗原反应的ScFv，为小鹅瘟的诊断和鹅γ-干扰素的检测提供了另一种物质材料。