一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法

摘要

本发明公开了一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法，包括以下步骤：姜黄样品和混合标准品的制备；姜黄样品的检测分析；姜黄样品定性定量分析；代谢组学数据的处理与分析；差异显著代谢物的筛选；对目标代谢物进行归一化处理，并通过MetaboAnalyst5.0在线软件绘制聚类热图，反映出代谢物的变化情况，筛选出不同品种姜黄的特征差异代谢物。利用本发明运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法寻找新品种姜黄，发现和培育产量高、含量高的优良品系，促进姜黄产业发展，解决姜黄药材供不应求问题，可为药用姜黄的药材来源提供新的选择。

说明书

技术领域

本发明属于姜黄品种鉴定技术领域，更具体的说是涉及一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法。

背景技术

2020年版《中国药典》记载，姜黄为姜科姜黄属植物姜黄CurcumaLongaL.的干燥根茎，具有破血行气，通经止痛的功效。用于胸胁刺痛，胸痹心痛，痛经经闭，癥瘕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛等的治疗。姜黄的活性成分主要包括姜黄素类化合物和挥发油。截至目前，研究者已从姜黄中分离得到30多种天然姜黄素类化合物，主要有姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素等，其中姜黄素含量最高，是其主要活性成分。药理学研究表明姜黄素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、神经保护等作用。此外，已有研究发现姜黄挥发性成分30多种，包括芳姜黄酮、α-姜黄酮、姜烯、芳姜黄烯、β-红没药烯等，具有抗突变、抗氧化、抗病毒、抗菌等药理作用。据医学百科网、药智数据网统计，以姜黄组成的中药方剂达212种，如七味姜黄搽剂、九味肝泰胶囊、双姜胃痛丸等。姜黄既是一种传统中药，又是咖喱的重要原料，同时还是风靡东西方的膳食补充剂。在食品应用上，姜黄主要用于食品着色剂，是九种天然色素之一，广泛应用于面食、饮料、果酒、糖果、糕点、罐头、果汁及烹饪菜肴等。

随着对姜黄化学成分和药理作用研究的深入，其市场需求量也日益增多，但是目前市场上姜黄的质量参差不齐，缺乏统一的质量标准，究其原因有3点：1、姜黄属植物种类众多，且药用部位根茎外观形态相似，难以辨认，导致部分市售姜黄药材中掺入其它姜黄属植物(如温郁金、莪术等)；2、印度、缅甸、越南等国家也是姜黄的主要生产出口国，但是这些姜黄一般用作色素或提取液的原料，不做药用；3、我国姜黄产地分布于福建、台湾、广东、广西、四川、云南及贵州等地，不同地区姜黄栽培品种质量差异较大，如梁立娟等对同一栽培基地3个不同的姜黄品种的产量和有效成分含量进行研究，发现不同品种姜黄的姜黄素和挥发油含量差异显著。关于姜黄的道地产区，郝宪恩等在＂姜黄的本草研究＂一文中指出：姜黄以四川犍为产区为其道地产区。依据《犍为县志》记载，犍为已栽培姜黄100多年，其种植以当地为道地产区。综上所述，四川犍为为姜黄的道地产区，质量最好，然而川姜黄产量不大，难以满足市场需求，迫切需要扩大道地药材种植面积或挖掘高含高产的姜黄优良品种资源以满足姜黄的巨大市场需求。云南姜黄品种因其个头大、含量低，价格低，主要作为工厂提取色素用。川姜黄因其个头小，皮薄，有效成分含量高，主要用作药材使用。2018年本研究组在云南西双版纳采集到一个野生高含姜黄品种，通过近三年的人工栽培育种，该品种姜黄素含量稳定，含量高于本地普通品种。该品种可能成为除川姜黄外的高质量姜黄药材品种，可为姜黄药材提供新的来源。

广泛靶向代谢组学分析是一种结合非靶向代谢组学和靶向代谢组学优点的新方法，利用基于多反应监测(multiplereactionmonitoring，MRM)模式的QTRAP质谱法，可同时定量数百个已知代谢物和近千种未知代谢物，实现了高灵敏度、广泛靶向代谢物的检测和鉴定。Jin等通过整合使用两个互补的液相色谱-质谱/质谱平台：液相色谱-四极杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS/MS)和液相色谱-四极杆线性离子阱质谱(LC-QTRAP-MS/MS)建立了姜黄素类代谢物谱，并分析鉴定了96个姜黄素类化合物。该研究基于LC-QTRAP-MS/MS平台MRM模式分析的姜黄素类化合物谱已成功应用于中国和缅甸不同地区姜黄原料的定性定量评价。因此，如何参考姜黄素类代谢物谱研发一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法，包括以下步骤：

(1)姜黄样品的制备：采集不同品种姜黄成熟期姜黄新鲜根茎，避光操作，切成均匀的薄片，于35℃的烘箱中烘干，粉碎并过60目筛，取1g姜黄粉末于10mL离心管中，加入10mL体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液，振摇1min，超声提取10min，12000rpm离心5min，分离上清液，残渣依次用10mL体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液和10mL甲醇分别提取1次，将三次提取液混合，取1mL提取液加甲醇定容至30mL，最后通过0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测液；

混合标准品的制备：精密称定姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去氧基姜黄素、二氢姜黄素及四氢姜黄素标准品分别溶解在色谱级甲醇中，制成五种浓度为100ug·mL

(2)姜黄样品的检测分析：将待测液采用高效液相色谱和串联质谱分析，色谱柱为C18，2.1mm×100mm，1.8μm；色谱条件：流动相：A相为0.1vol％的甲酸水，B相为乙腈；梯度洗脱的程序及流动相B占A+B的体积百分比浓度：0–10min，流动相B:A+B为20–35％；10–30min，流动相B:A+B为35–55％；30–33min，流动相B:A+B为55-95％；33-36min，流动相B:A+B为95％；36–36.5min，流动相B:A+B为95–20％；36.50-40min，流动相B:A+B为20％；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL；

质谱条件：ESI离子源，扫描模式为正离子模式，气帘气、雾化气和辅助气分别为30psi、50psi和50psi，喷雾电压为5500V，离子源温度为550℃，去簇电压为80V，碰撞池出口电压为10V，碰撞能量CE和CES分别为30eV和10eV，驻留时间为10ms；

(3)姜黄样品定性定量分析：采用多反应监测-信息依赖型采集-增强子离子扫描模式，对不同品种姜黄样品和混合标准品进行数据采集，利用Analyst1.6.2软件进行质谱数据处理，获得不同品种姜黄样品和混合标准品的总离子流图，通过多反应监测-信息依赖型采集-增强子离子扫描模式下获得化合物的碎片离子信息，结合离子对、保留时间及现有数据库姜黄素类代谢物谱匹配鉴定得到目标代谢物，同时利用MRM扫描获得各代谢物的峰面积，确定不同品种中各代谢物的含量变化；

(4)代谢组学数据的处理与分析：采用正交偏最小二乘判别分析结合正交信号矫正和偏最小二乘判别分析方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量，根据正交偏最小二乘判别分析得分图对代谢物数据进行分析，对不同品种样本分别进行两两分组比较，建立正交偏最小二乘判别分析模型进行分析，分析模型的预测能力和可靠性，根据VIP值＞1分析筛选其差异代谢物；

(5)差异显著代谢物的筛选：基于正交偏最小二乘判别分析，根据IP值＞1及Log2FC＞1.2筛选出差异显著代谢物；

(6)对目标代谢物进行归一化处理，并通过MetaboAnalyst5.0在线软件绘制聚类热图，反映出代谢物的变化情况，筛选出未知姜黄品种的特征差异代谢物。

本发明的有益效果是：利用本发明运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法寻找新品种姜黄，发现和培育产量高、含量高的优良品系，促进姜黄产业发展，解决姜黄药材供不应求问题，可为药用姜黄的药材来源提供新的选择。

本发明通过姜黄素类代谢物的定性定量分析有效区别鉴定不同姜黄品种。

附图说明

图1为混标和三个姜黄品种的总离子流图，A混标，峰1为四氢姜黄素，峰2为二氢姜黄素，峰3为姜黄素，峰4为甲氧基姜黄素，峰5为双去氧基姜黄素；B高含姜黄；C川姜黄；D云姜黄；

图2为姜黄总离子色谱图及姜黄素类成分的EPI扫描质谱图；

图3为OPLS-DA得分图，GH为高含姜黄；YJH为云姜黄，CJH为川姜黄；

图4为全部样品代谢物聚类热图，GH为高含姜黄；YJH为云姜黄，CJH为川姜黄，纵轴表示代谢物组分，横轴表示不同样本；红色表示代谢物相对量高，蓝色表示相对量低；

图5为自组织映射聚类分析，GH为高含姜黄；YJH为云姜黄，CJH为川姜黄。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例将待鉴别姜黄命名为高含姜黄。

运用广泛靶向代谢组学技术鉴别姜黄品种的方法，包括以下步骤：

(1)姜黄样品的制备：采集云姜黄、川姜黄和高含姜黄成熟期姜黄新鲜根茎，避光操作，切成均匀的薄片，于35℃的烘箱中烘干，粉碎并过60目筛，取1g姜黄粉末于10mL离心管中，加入10mL体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液，振摇1min，超声提取10min，12000rpm离心5min，分离上清液，残渣依次用10mL体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液和10mL甲醇分别提取1次，将三次提取液混合，取1mL提取液加甲醇定容至30mL，最后通过0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测液，并保存于进样瓶中进样分析；

混合标准品的制备：精密称定姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去氧基姜黄素、二氢姜黄素及四氢姜黄素标准品分别溶解在色谱级甲醇中，制成五种浓度为100ug·mL

(2)姜黄样品的检测分析：将待测液采用高效液相色谱和串联质谱分析，色谱柱为C18，2.1mm×100mm，1.8μm；色谱条件：流动相：A相为0.1vol％的甲酸水，B相为乙腈；梯度洗脱的程序及流动相B占A+B的体积百分比浓度：0–10min，流动相B:A+B为20–35％；10–30min，流动相B:A+B为35–55％；30–33min，流动相B:A+B为55-95％；33-36min，流动相B:A+B为95％；36–36.5min，流动相B:A+B为95–20％；36.50-40min，流动相B:A+B为20％；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL；

质谱条件：ESI离子源，扫描模式为正离子模式，气帘气、雾化气和辅助气分别为30psi、50psi和50psi，喷雾电压为5500V，离子源温度为550℃，去簇电压为80V，碰撞池出口电压为10V，碰撞能量CE和CES分别为30eV和10eV，驻留时间为10ms；

(3)姜黄样品定性定量分析：采用多反应监测-信息依赖型采集-增强子离子扫描模式，对不同品种姜黄样品和混合标准品进行数据采集，利用Analyst1.6.2软件进行质谱数据处理，获得不同品种姜黄样品和混合标准品的总离子流图如图1所示，通过多反应监测-信息依赖型采集-增强子离子扫描模式下获得化合物的碎片离子信息如图2所示，结合离子对、保留时间及现有数据库姜黄素类代谢物谱匹配鉴定得到46种姜黄素类化合物，其中高含姜黄和川姜黄中均检出46种姜黄素类化合物，而云姜黄检出36种姜黄素类化合物，同时利用MRM扫描获得各代谢物的峰面积，确定不同品种中各代谢物的含量变化，三个姜黄品种的代谢物统计见表1；

表1三个姜黄品种的代谢物统计

注：“ol”表示相应姜黄素化合物的烯醇式结构，“/”代表云姜黄未检出

46种姜黄素类代谢物的化学结构式如下：

(4)代谢组学数据的处理与分析：采用正交偏最小二乘判别分析结合正交信号矫正和偏最小二乘判别分析方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量，根据正交偏最小二乘判别分析得分图如图3所示，对代谢物数据进行分析，高含姜黄品种样品分布在置信区间的左下侧，云姜黄处于置信区间的中上部，川姜黄样品分布在置信区间的右下侧，三个样品的区分效果明显，对不同品种样本分别进行两两分组比较，比较组为：高含姜黄:云姜黄(GH:YJH)、高含姜黄:川姜黄(GH:CJH)、云姜黄:川姜黄(YJH:CJH)，建立正交偏最小二乘判别分析模型进行分析，见表2。

表2样品分组比较的R

表2显示3组比较OPLS-DA模型的R

(5)差异显著代谢物的筛选：基于OPLS-DA生成的第1主成分变量重要性投影VIP值＞1及Log2FC＞1.2筛选出10种差异显著代谢物如表3所示；

表3三种姜黄中差异代谢物

(6)对46种代谢物进行归一化处理，并通过MetaboAnalyst5.0在线软件绘制聚类热图，如图4所示，反映出代谢物的变化情况，图中颜色表示相对含量，红色越深表示含量越高；蓝色越深表示含量越低。结果如图4和表1所示，所有代谢物在高含姜黄、云姜黄、川姜黄中的含量差异明显，除化合物40和化合物45外，高含姜黄中姜黄素类化合物含量最高，聚集区显示红色，其中姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去氧基姜黄素、二氢姜黄素及四氢姜黄素等代谢物的含量相对较高，化合物45在云姜黄中含量远高于高含姜黄和川姜黄，化合物40在川姜黄中含量远高于高含姜黄和云姜黄，是相应品种的特征差异代谢物。

根据代谢物层次聚类分析和自组织映射聚类分析如图4、图5所示，三个姜黄品种分为2支，高含姜黄和川姜黄聚为一支和云姜黄分离。图4所示高含姜黄的姜黄素类代谢物含量整体高于川姜黄和云姜黄，且与川姜黄的姜黄素类代谢物组成相似，分析结果进一步提示高含姜黄与川姜黄质量相当甚至更优，而与云姜黄差异较大。高含姜黄是除川姜黄外的高质量姜黄品种，可为药用姜黄的药材来源提供新的选择。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。