用于改善皮肤健康和用于治疗和预防与病原微生物相关联的疾病、疾患和病症的组合物和方法

摘要

本文公开了使用人源蓝黑紫色杆菌的组合物和方法。组合物改善了皮肤健康。方法可包括在宿主或宿主区域，诸如皮肤或粘膜上施加人源蓝黑紫色杆菌，以最小化一种或多种微生物的存在、最大化治疗效应、和/或改善健康。一种使病原微生物最小化的方法可包括向表面施加组合物，所述组合物包含人源蓝黑紫色杆菌和一种可接受的载剂。组合物和方法可包含益生元以最大化生长和/或代谢物。组合物和方法可包含人源蓝黑紫色杆菌代谢物，诸如紫色杆菌素、灵菌红素、吲哚‑3‑甲醛和羊毛硫细菌素、和/或其他后生元。

说明书

1.相关申请的交叉引用

本申请要求2019年4月9日提交的美国临时专利申请号62/920,010的优先权和权益，该美国临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。

2.技术领域

本发明提供了用于使用人源蓝黑紫色杆菌(Janthinobacterium lividum)、人源蓝黑紫色杆菌的代谢物、细胞裂解物或后生元以及含有蓝黑紫色杆菌的组合物、制剂和产品来改善皮肤健康和抑制、治疗及预防与病原微生物或微生物相关联的疾病、疾患和病症的有益组合物和方法，所述组合物、制剂和产品用于化妆品和消费者用途。

3.背景技术

由病原微生物引起的皮肤、指甲、粘膜和粘液腔的局部感染是许多人和受试者的健康问题。这些微生物导致各种细菌、病毒、酵母和真菌感染。这些病症可能由皮肤、指甲、粘膜和粘液腔的生态失调引起，从而允许病原微生物和/或病原微生物群落得以建立。

存在多种影响相对大量的人类群体的感染，诸如细菌、病毒、酵母和/或真菌感染。潜在病原真菌包括酵母菌(例如，白假丝酵母(Candida albicans))和皮肤真菌。皮肤真菌是需要角蛋白用于营养并且必须生活在角质层、毛发或指甲上才能存活的霉菌。人类感染由毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)和表皮癣菌属(Epidermophyton)物种引起。红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)占全球皮肤和指甲真菌病的约46％至72％。研究已证实最常见的皮肤真菌红色毛癣菌和金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分别是足癣和特应性皮炎的致病微生物。甲癣是一种常见且持续的真菌感染，全球人口中有2％至8％被诊断为患有甲真菌病。这种疾病会导致指甲外形毁损和/或疼痛。皮肤真菌病的治疗包括抗真菌局部产品(例如，特比萘芬、伊曲康唑、咪康唑等)和/或全身疗法。一些长期治疗的无效性和毒性以及抗真菌药物耐药性和感染复发已经导致了对替代治疗的需求。

本文描述了使用人源蓝黑紫色杆菌治疗、抑制或预防病原微生物的组合物和方法。所述组合物和方法可用于调节微生物群系以有效抑制、治疗或预防微生物感染。这些组合物和方法包含用于本发明目的的人源蓝黑紫色杆菌的产品。

本文还描述了用于使用人源蓝黑紫色杆菌改善皮肤健康、减少暴露于阳光的影响和衰老的局部组合物和化妆品组合物和方法。

4.发明内容

本文公开了药物组合物，所述药物组合物包含有效用于抑制、治疗或预防局部病原微生物的量的至少一种从人分离的蓝黑紫色杆菌。本文还公开了药物组合物，所述药物组合物包含有效用于抑制、治疗或预防局部病原微生物的量的一种或多种人源蓝黑紫色杆菌代谢物。本文还公开了药物组合物，所述药物组合物包含有效用于抑制、治疗或预防局部病原微生物的量的一种或多种人源蓝黑紫色杆菌细胞裂解物。本文公开了药物组合物，所述药物组合物包含赋形剂以及人源蓝黑紫色杆菌和/或来源于人源蓝黑紫色杆菌的物质，所述人源蓝黑紫色杆菌和/或来源于人源蓝黑紫色杆菌的物质的量有效用于抑制、治疗或预防局部病原微生物；以及使用这些药物组合物抑制、治疗或预防病原微生物的方法。这些药物组合物可经配制以施加至皮肤、粘膜、毛发和/或指甲。

本文公开了合成组合物，所述合成组合物包含益生性人源蓝黑紫色杆菌、来自益生性人源蓝黑紫色杆菌的代谢物、益生性人源蓝黑紫色杆菌的细胞裂解物、和/或经配制以用于局部施用的来自人源蓝黑紫色杆菌的后生元。这些合成组合物可经配制以施加至受试者(例如皮肤、粘膜、毛发、指甲)或与受试者接触的物体(例如，布、地板等)。在一些实施方案中，这些合成组合物是化妆品组合物。

在一些实施方案中，本发明的组合物还包含益生元。在优选实施方案中，益生元选自氨基酸、生物素、甘油、低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、乳果糖、低聚甘露糖、富含果寡糖的菊粉、果寡糖、低聚葡萄糖、塔格糖、反式低聚半乳糖和低聚木糖中的一者或多者。在一些实施方案中，药物组合物还包含分离的非病原性附加微生物。在优选实施方案中，附加的分离微生物选自乳杆菌属(Lactobacillus)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、通常在人类皮肤上发现的良性真菌物种或丙酸杆菌属(Propionibacterium)物种。在一些实施方案中，该组合物经配制以用于与附加的抗真菌或抗细菌化合物一起施用。在一些实施方案中，药物组合物经配制以用于局部施用至皮肤或粘膜。在一些实施方案中，组合物是用于粘膜腔的递送装置的一部分。

在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌的核酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7标识。在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌包含与SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、或SEQ ID NO:7至少90％同一；或在16s rRNA基因序列处与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7至少93％同一，或至少95％、或至少97％、或至少98％，或至少99％，或100％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌包含与SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、或SEQ ID NO:7至少90％同一，与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7至少92％同一；或与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7至少93％同一，或至少95％、或至少97％、或至少98％，或至少99％、或100％同一的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7与人源蓝黑紫色杆菌核酸序列在16s rRNA基因序列处至少90％同一；或与人源蓝黑紫色杆菌核酸序列在16s rRNA基因序列处至少90％同一；或至少93％同一，或至少95％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一。

在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗酵母病原微生物，诸如白假丝酵母、光滑假丝酵母(C.glabrata)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)或乳酒假丝酵母(C.kefyr)。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗真菌病原微生物，诸如毛癣菌属或马拉色氏霉菌属物种。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗真菌病原微生物，诸如红色毛癣菌(T.rubrum)、疣状毛癣菌(T.verrucosum)、断发毛癣菌(T.tonsurans)、土壤毛癣菌(T.terrestre)、须发癣菌(T.interdigitale)。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗细菌病原微生物，诸如葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠球菌属(Enterococcus)和金黄色酿脓葡萄球菌(S.aureus)。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗病毒病原微生物，诸如脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒、腺病毒、SARS-CoV-2和甲型流感病毒。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗选自由以下组成的组的病原微生物：阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、白假丝酵母、阴道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)和沙门氏菌属(Salmonella)。

在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌的代谢物可溶于制剂中以用于局部施用。在一些实施方案中，药物组合物包含选自紫色杆菌素、吲哚-3-甲醛、灵菌红素、水杨酸酯、2,4-二氨基丁酸盐和一种或多种羊毛硫细菌素的代谢物。在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌产生选自紫色杆菌素、吲哚-3-甲醛、灵菌红素、水杨酸酯、2,4-二氨基丁酸盐和一种或多种羊毛硫细菌素的抗微生物代谢物，所述抗微生物代谢物的水平高于其他非人源蓝黑紫色杆菌参考菌株的微生物代谢物水平。

在一些实施方案中，在用单独存储的无菌液体重构之前，包含人源蓝黑紫色杆菌的药物组合物是无水的，在-20℃冷冻，或在-80℃冷冻。在一些实施方案中，用于重构的液体选自眼用润滑剂、甘油、蔗糖、甘露醇、2-羟乙基淀粉(HES)、Noveon AA-1聚卡波非、Methocel F4M(HPMC)、羧甲基纤维素、和/或包括λ-角叉菜胶。

在一些实施方案中，本文所述的人源蓝黑紫色杆菌组合物用于抑制、治疗或预防病原微生物的方法中，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的人源蓝黑紫色杆菌、人源蓝黑紫色杆菌的代谢物和/或细胞裂解物，其中所述人源蓝黑紫色杆菌、人源蓝黑紫色杆菌的代谢物和/或细胞裂解物以有效抑制、治疗或预防至少一种病原微生物的量存在。在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌与附加的抗真菌剂或抗细菌剂联合施加。在一些实施方案中，组合物具有附加的益生性或非病原微生物。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物、合成组合物、化妆品组合物和益生性组合物含有至少10个、10

本文公开了制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含有效量的益生性人源蓝黑紫色杆菌、任选的代谢物、细胞裂解物和/或益生元，以及药学上可接受的赋形剂，所述方法包括在含有增强保存的赋形剂的药物制剂存在下通过喷雾干燥或冻干保存人源蓝黑紫色杆菌，以及包装保存的人源蓝黑紫色杆菌，以便在施用前立即用第二赋形剂制剂重构以产生制剂。在一些实施方案中，赋形剂选自由以下组成的组：氨基酸、复合碳水化合物、简单碳水化合物、DMSO、甘露醇、天然泪液、眼用润滑剂、海藻糖和甘油。

本文描述了一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一小瓶稳定化的人源蓝黑紫色杆菌和任选的至少一小瓶用于重构所述稳定化的人源蓝黑紫色杆菌的液体、用于混合和施加的使用说明书，以及任选的一种或多种混合和施加工具。在一些实施方案中，混合和应用工具被包括，并且包括选自注射器、空无菌容器和喷雾器或弥雾器(mister)的一个或多个元件。在一些实施方案中，所述试剂盒包含多个小瓶的稳定化的人源蓝黑紫色杆菌和至少一小瓶用于重构稳定化的人源蓝黑紫色杆菌的液体，以用于多次施加至一个或多个有需要的受试者。在一些实施方案中，试剂盒是为由医学专业人员应用而准备的。在一些实施方案中，试剂盒是为由患者应用而准备的。

5.附图说明

图1示出了从人的足跟、人的前额和萝卜中分离的蓝黑紫色杆菌的代表性示例，所有这些蓝黑紫色杆菌都生长在有盖培养皿中。

图2示出了健康皮肤上蓝黑紫色杆菌的盛行率和丰度，所述盛行率和丰度是使用作为16s rRNA基因的一部分的下一代测序读段估计的。

图3示出了系统发生树，所述系统发生树可视化了使用全基因组ANI比较进行的多个蓝黑紫色杆菌分离株之间的遗传比较，从而证明分离出了多个不同组的蓝黑紫色杆菌。

图4示出了蓝黑紫色杆菌DB02473显著抑制在琼脂平板上生长的红色毛癣菌的生长。

图5示出了使用BD BBL Sensi-Discs时，蓝黑紫色杆菌菌株对10种抗生素敏感。

图6示出了来自纯度测定的图像，证明了制造期间没有污染。A-F107摇瓶，B-F107收获，C-F108摇瓶，D-F108收获。

图7示出了来自F107(A)和F108(B)发酵罐样本的以CFU/ml为单位的蓝黑紫色杆菌活力计数，所述F107(A)和F108(B)发酵罐样本在收获时直接铺板(WPI)并在离心和重悬于冷冻保护剂媒介物(Tufts)后直接铺板。

图8示出了拉姆齐测定(Ramsey assay)的代表性图像(实施例4)。图像显示4个单独的红色毛癣菌18754菌落(A、C)或与10

图9示出了所制造的蓝黑紫色杆菌菌株的有效性，如模拟对照红色毛癣菌生长半径与在生长34天后F107和F108收获样本的稀释液之间的所示差异所证明的。

图10示出了来自金黄色酿脓葡萄球菌抗生测定的代表性结果。实施例4中描述了详细的方法。

6.具体实施方式

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅为通过举例方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可想到许多变化、改变和替换。应当理解的是，可采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。

本文描述了益生菌人源蓝黑紫色杆菌。本文描述了包含具有抗微生物和其他有益特性的益生菌人源蓝黑紫色杆菌的组合物。使人源蓝黑紫色杆菌适应人类宿主，从而确保其对人类应用是安全的并且被配置为在人类宿主上存活达至少长到足以治疗有效的时间。优选的组合物是一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种人源蓝黑紫色杆菌，所述至少一种人源蓝黑紫色杆菌的量有效治疗、抑制或预防局部病原微生物。另一种优选的组合物是一种合成组合物，所述合成组合物包含益生性人源蓝黑紫色杆菌，所述益生性人源蓝黑紫色杆菌经配制用于局部施加以调节施加对象的微生物群系。

在本发明的一个优选实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌、代谢物、后生元和/或细胞裂解物的组合物经配制用于施用至皮肤。在本发明的另一优选实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌、代谢物、后生元和/或细胞裂解物的组合物经配制用于施用至粘膜。

还应当理解的是，用于本发明的制剂可包含至少一种益生菌、至少一种益生菌代谢物、至少一种益生菌细胞裂解物或益生菌后生元中的一者或多者。

将进一步理解的是，制剂可包含多于一种细菌、可溶性代谢物、细胞裂解物或后生元。例如，制剂可包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、12种、15种或20种细菌、培养物、它们的代谢物、细胞裂解物或后生元。

本领域技术人员应当理解的是，如本文所用，术语“益生性”是指活微生物、微生物或活培养物(包括例如细菌或酵母)，所述活微生物、微生物或活培养物以足够的数量提供，有益地影响宿主生物，即通过赋予宿主生物一种或多种可证明的健康益处。“益生菌(probiotic bacterium/probiotic bacteria)”或“益生微生物(probioticmicroorganism/probiotic microbe)”或“益生培养物”是细菌、微生物、培养物或细菌，所述细菌、微生物、培养物或细菌以足够的数量提供，有益地影响宿主生物，即通过赋予宿主生物一种或多种可证明的健康益处。

如本文所用，术语“细胞裂解物”或“裂解物”是指已经通过任何合适的手段裂解的益生细胞。在优选实施方案中，在使用前去除细胞碎片。在更优选的实施方案中，在使用前过滤细胞裂解物。在示例性实施方案中，将细胞通过例如超声处理、均质化、剪切或化学裂解来裂解。

如本文所用，术语“后生元”是指由益生菌产生的功能性生物活性化合物，所述功能性生物活性化合物可用于促进健康。术语后生元可以被视为这些微生物组分的所有同义词和相关术语的涵盖性术语。因此，后生元可包括许多不同的成分，包括代谢物、短链脂肪酸(SCFA，例如乙酸、丙酸和丁酸)、微生物细胞级分、功能蛋白、胞外多糖(EPS)、细胞裂解物、磷壁酸、苯基乳酸、挥发性有机化合物(VOC)、B族维生素合成物(生物素、钴胺素、叶酸、烟酸、泛酸、吡哆醇、核黄素和硫胺素)、肽聚糖衍生的胞壁肽、抗微生物肽(AMP)和菌毛型结构。

适用于本发明的益生菌包括但不限于来自人源紫色杆菌属和任何附加非病原微生物(诸如双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus))、肠球菌属(Enterococcus)、小球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和/或酒球菌属(Oenococcus))。

用于本发明的可溶性代谢物包括但不限于来自人源蓝黑紫色杆菌和任何附加非病原微生物(诸如双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属(例如嗜酸乳杆菌)、肠球菌属、小球菌属、明串珠菌属和/或酒球菌属)的可溶性代谢物。

用于本发明的细胞裂解物包括但不限于来自人源紫色杆菌属和任何附加非病原微生物(诸如双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属(例如嗜酸乳杆菌)、肠球菌属、小球菌属、明串珠菌属和/或酒球菌属)的细胞裂解物。

如本文所用，术语“可溶性代谢物”是指已去除细胞的细胞培养物的上清液中存在的一种或多种代谢物。在优选实施方案中，培养物生长至细胞密度为至少约OD

当在本文中使用时，术语局部包括对适用于施加至身体表面(例如皮肤、粘膜或黏膜)的制剂的提及。皮肤包括外表面诸如手指和脚趾甲。在这方面可以提及的黏膜或粘膜包括阴道粘膜、阴茎粘膜、尿道粘膜、膀胱粘膜、肛门粘膜、结肠粘膜、口腔粘膜(包括颊粘膜、软腭粘膜、舌下表面粘膜和口底粘膜)、鼻粘膜、咽喉粘膜(包括咽粘膜、喉粘膜、气管粘膜和食道粘膜)、支气管粘膜、肺粘膜、眼粘膜和耳粘膜。

术语“改善”是指在疾病状态，例如代谢性疾病状态的治疗中的任何治疗上有益的结果，包括预防疾病状态、减轻疾病状态的严重性或进展、缓解或治愈疾病状态。

术语“原位”是指发生在与活生物体分离生长，例如在组织培养物中生长的活细胞中的过程。

术语“体内”是指发生在活生物体中的过程。

如本文所用的术语“哺乳动物”包括人和非人两者，并且包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠类、牛、马和猪。

如本文所用，术语“来源于”包括直接取自环境样本的微生物或其他活培养物，以及从环境来源分离并随后在纯培养物或分离物中生长的微生物或其他活培养物。

如本文所用，术语“菌株”被定义为与所定义的16s rRNA核酸序列97％或更大同一的任何核酸序列。菌株的更优选实施方案是与所定义的16s rRNA核酸序列大于98％、大于99％同一的核酸序列。

在两个或更多个核酸或多肽序列的情境中，术语“同一性百分比”是指当如使用下述序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可获得的其他算法)中的一种序列比较算法或通过目视检查所测量进行比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。取决于应用，“同一性”百分比可存在于被比较的序列的某一区域上，例如在功能结构域上，或者存在于待比较的两个序列的全长上。在一些方面中，同一性百分比是关于可用于表征两种或更多种生物(包括两种或更多种微生物)的系统发生相似性的区域来定义的。在这些情况下，同一性百分比可以通过以下方式来确定：在更大序列的情境中鉴定此类序列，所述更大序列可包括通过克隆或测序操纵引入的序列，诸如引物、接头等；以及分析感兴趣区域中的同一性百分比，而不在那些分析中包括引入的未告知系统发生相似性的序列。

对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果需要的话指定后续坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以通过例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)；或通过目视检查(一般参见Ausubel等人，下文)来进行。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个示例是BLAST算法，该算法描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。

术语“足够量”是指足以产生所需效应的量，例如足以改变受试者微生物菌群的微生物含量的量。

术语“治疗量”是开处方的抗微生物化合物，例如抗真菌或抗细菌化合物的量。低于通常开处方的浓度的浓度被称为“亚治疗”量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和工序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或容易从已知的方式、手段、技术和工序发展出的那些方式、手段、技术和工序。

如本文所用，术语“抑制”包括使病症的进展或生长停止、基本上防止病症或生长或基本上治疗病症或非期望的生长。如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状。

如本文所用，术语“预防”包括完全或基本上减少病症的初始临床或美学症状的可能性或发生或严重性。

如本文所用，术语“病原体”是指疾病、疾患或病症以及与该疾病或感染相关联的微生物。例如：须癣是胡须区域的皮肤真菌感染，最常由须癣毛癣菌或疣状毛癣菌引起。头癣是由断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)、犬小孢子菌(Microsporum canis)和奥杜盎小孢子菌(M.audouinii)；其他毛癣菌属物种(例如，许兰毛癣菌(T.schoenleinii)、紫色毛癣菌(T.violaceum))引起的皮肤真菌病。体癣是面部、躯干和四肢的皮肤真菌感染，通常由须癣毛癣菌、红色毛癣菌和犬小孢子菌引起。股癣是通常由红色毛癣菌或须癣毛癣菌引起的皮肤真菌病。足癣是通常由红色毛癣菌引起的足部皮肤真菌感染。癣菌疹(一致性或id)反应是千变万化的；它们与真菌的局部生长无关，而是与身体上其他地方的皮肤真菌病的炎症反应。与但不限于特应性皮炎、脓疱病、皮肤和软组织感染相关的其他疾病、疾患或病症通常由革兰氏阳性细菌和葡萄球菌属引起。

如本文所用，术语“约”包括至多约+/-10％的变化，并且允许产品中的功能等同性。

如本文所用，术语“菌落形成单位”或“CFU”是能够将自身克隆成具有相同细胞的完整菌落的单个细胞。

除非另有说明，否则如本文所用的所有百分比都是重量百分比。

如本文所用，“活生物体”是能够生长和繁殖的生物体。在一些实施方案中，活力可以通过可培养的菌落形成单位的数量来评定。在一些实施方案中，活力可以通过其他手段，诸如定量聚合酶链式反应来评定。

术语“来源于”包括从所述来源分离的材料，以及使用分离的材料获得的材料(例如，由从所述来源分离的微生物制成的微生物培养物)。

“微生物菌群”是指在动物受试者(通常是哺乳动物，诸如人类)内或上(持续或短暂)出现的微生物群落，包括真核生物、古细菌、细菌和病毒(包括细菌病毒，即噬菌体)的群落。

“微生物群系”是指持续和短暂地活在人体内和人体上的微生物或活培养物，包括真核生物、古细菌、细菌和病毒(包括细菌病毒(即，噬菌体))的群落的遗传内容，其中“遗传内容”包括基因组DNA、RNA诸如核糖体RNA、表观基因组、质粒和所有其他类型的遗传信息。

术语“受试者”指任何动物受试者，包括人类、实验动物(例如，灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)和家庭宠物(例如，狗、猫和啮齿动物)。受试者可能患有生态失调，包括但不限于由病原微生物引起的感染，或者可能有发展出或向他人传播由病原微生物引起的感染的风险。

宿主生物的“定殖”包括细菌或其他微生物的非暂时停留。如本文所用，“减少病原细菌对宿主受试者的皮肤(或任何其他微生物生态位)的定殖”包括减少病原体在皮肤上的停留时间以及减少在皮肤上或附着至皮肤的病原体的数量(或浓度)。测量附着病原体的减少可以例如通过活检样本、通过擦拭皮肤来证明，或者可以间接地测量减少。

两种或更多种细菌的“组合”包括两种细菌在同一材料或产品中或在物理连接的产品中的物理共存，以及两种细菌的暂时共施用或共定位。

如本文所用，“干燥”是指脱水，通常是通过冻干、冷冻干燥或喷雾干燥进行。

在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围格式呈现。应当理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本发明范围的不灵活限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。

应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供，或者以任何合适的子组合提供，或者适合于本发明的任何其他所述的实施方案。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的基本特征，除非该实施方案在没有那些元件的情况下不起作用。

必须注意，如说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。

紫色杆菌属

紫色杆菌属是革兰氏阴性β变形杆菌属，通常存在于包括人体在内的许多环境生态位中。蓝黑紫色杆菌针对其保护两栖动物免受真菌感染的能力而被鉴定出。在一些实施方案中，蓝黑紫色杆菌菌株是从环境来源中分离的。在一个优选的实施方案中，蓝黑紫色杆菌菌株最初来源于人类来源。在一个实施方案中，与参照菌株相比，人源蓝黑紫色杆菌菌株在人类皮肤上表现出优异的持久性。在一个实施方案中，与参考菌株相比，人源蓝黑紫色杆菌菌株表现出代谢物或后生元的卓越或过量产生。在此类实施方案中，参考蓝黑紫色杆菌菌株可以是从不同的环境生态位(诸如蝾螈皮肤、产品等)分离的菌株。

蓝黑紫色杆菌产生以下几种具有抗微生物效应的代谢物：紫色杆菌素、吲哚-3-甲醛、灵菌红素、水杨酸酯、2,4-二氨基丁酸盐和一种或多种羊毛硫细菌素。紫色杆菌素是一种双吲哚化合物，因其紫色和抗菌特性而知名。吲哚-3-甲醛具有作为植物代谢物、人异生物质代谢物、细菌代谢物和海洋代谢物的作用。它是杂芳烃甲醛，吲哚生物碱，也是吲哚的成员。灵菌红素是一种生物碱，是红色的，是次生代谢物，往往与沙雷氏菌属(Serratia)相关联。灵菌红素分子通过它们共同的吡咯基吡咯亚甲基骨架来鉴定，并且已经被证明具有多种生物活性，包括抗微生物活性。

羊毛硫细菌素是细菌素的一个子集，是含有分子内环结构的经遗传编码的肽，羊毛硫细菌素中的许多羊毛硫细菌素已被证明具有抗微生物特性。羊毛硫细菌素肽经翻译后修饰以形成其特征性环结构。最众所周知的羊毛硫细菌素中的一种羊毛硫细菌素是尼生素。

在一些实施方案中，将紫色杆菌属菌株与参考菌株进行比较。在一些实施方案中，参考菌株是从另一个环境生态位分离的另一种紫色杆菌属菌株。在一些实施方案中，将本申请的人源蓝黑紫色杆菌与从两栖动物物种中分离的蓝黑紫色杆菌菌株进行比较，发现其相较于两栖动物源物种和植物源物种提供了益处。在一些实施方案中，益处是延长了在人类皮肤上的寿命。在一些实施方案中，益处是增加了紫色杆菌素、吲哚-3-甲醛、灵菌红素、水杨酸酯、2,4-二氨基丁酸盐和一种或多种羊毛硫细菌素的产量。在一些实施方案中，益处是增加了2-(α-D-甘露糖基)-D-甘油酸、2-酮葡糖酸盐、2-O-乙基抗坏血酸、安曲霉素、抑肽酶、阿普比妥(Aprobarbital)、噁虫威(bendiocarb)、邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯、顺式-5-十四碳酰肉碱、邻苯二甲酸二丁酯、咪唑丙酸盐、吲哚-3-羧酸盐、吲哚啉-2-酮、N-乙酰基-L-天冬氨酸、磷酸、邻苯二甲酸、匹米前列素、三甲二酮和灭草猛(Vernolate)的产量。

在一些实施方案中，相对于其他菌株(例如，参考菌株)，人源蓝黑紫色杆菌或分离的人源蓝黑紫色杆菌过量产生或过量表达其化合物(例如，代谢物，例如，紫色杆菌素、吲哚-3-甲醛、灵菌红素、水杨酸酯、2,4-二氨基丁酸盐和一种或多种羊毛硫细菌素)。如所使用的，术语“过量产生”和“过量表达”(分别)是指相对于其他菌株(例如，参考菌株)至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、1.5倍、2倍、2.5倍或3倍多的产量或表达。在此类实施方案中，参考蓝黑紫色杆菌菌株可以是从不同的环境生态位(诸如蝾螈皮肤、产品等)分离的菌株。如本文所用，术语“过量产生”是指由生物体产生化合物(例如，代谢物)，术语“过量表达”是指产生化合物(例如，代谢物)的基因的表达。

益生元

根据本发明的教导，益生元包括促进有益细菌生长的组合物。益生元物质可被相关益生菌消耗，或以其他方式帮助相关益生菌存活或刺激其生长。当以有效量施加或消耗时，益生元还有益地影响受试者的天然存在的微生物群系，并由此赋予健康益处。益生元食物进入结肠并充当内源性细菌的底物，从而间接为宿主提供能量、代谢底物和必需的微量营养素。益生元也可以添加到任何益生菌组合物中，以增强益生菌菌株的有效性或寿命。

益生元有助于益生菌在其环境中茁壮成长，并且因此它们的健康益处在很大程度上是间接的。例如，由肠道微生物菌群通过结肠发酵产生的代谢物，诸如短链脂肪酸，可在宿主的健康中发挥重要的功能作用。益生元可为用于增强人类微生物菌群为其宿主提供益处的能力的有用试剂。

根据本发明的实施方案，益生元包括但不限于氨基酸、甘油、粘多糖、寡糖、多糖、氨基酸、维生素、营养前体、蛋白质，以及它们的组合。

根据特定实施方案，组合物包含益生元，所述益生元包括但不限于氨基酸、甘油、多糖和寡糖。这些化合物具有增加益生菌的数量并增加其相关益处的能力。例如，有益双歧杆菌的增加可能会改变肠道pH以支持双歧杆菌的增加，从而减少病原生物体。

根据特定实施方案归类为益生元的寡糖的非限制性示例包括低聚半乳糖、低聚果糖、菊粉、低聚异麦芽糖、乳糖醇、低聚乳果糖、乳果糖、焦糊精、大豆低聚糖、低聚反式半乳糖和低聚木糖。

根据其他特定实施方案，组合物包含含有氨基酸的益生元。

在一个实施方案中，包含益生元以增加一种或多种有益代谢物的产量。在一个实施方案中，包括色氨酸和/或甘油以增加紫色杆菌素的产量。

在一个实施方案中，添加益生元，所述益生元另外用作冷冻保护剂。

本文所述组合物的剂量被认为是“有效剂量”，表明益生性或益生元组合物以足以以所需方式改变受试者的生理的量施用。

优选的实施方案是改进人源蓝黑紫色杆菌的生长的益生元，诸如选自D-甘露醇、吐温20、吐温40和胞苷的益生元

优选的实施方案是增强人源蓝黑紫色杆菌的功能的益生元，诸如选自表1的益生元。

更优选的实施方案是增强人源蓝黑紫色杆菌的功能的益生元，诸如选自下表中由“+”标识的益生元。

表1.用于增强人源蓝黑紫色杆菌的功能的组分

*在18小时时比阴性对照大0.1OD单位或更高

制剂

在一些方面中，本文提供了包含本文公开的人源蓝黑紫色杆菌的至少一种菌株的组合物，其中所述组合物经配制以用于施用至有需要的受试者。通常，受试者是患有皮肤和/或粘膜的局部病原微生物感染的人。在一些实施方案中，所述组合物经配制以用于局部施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，所述组合物经配制以用于局部施用至受试者的皮肤。在一些实施方案中，所述组合物经配制以用于局部施用至受试者的头皮。在一些实施方案中，组合物经配制以用于施加至粘膜表面。在一些实施方案中，组合物经配制以用于口服施用。在一些实施方案中，组合物经配制以用于经皮施用。在一些实施方案中，组合物经配制以用于注射施用。在某些实施方案中，该组合物是选自凝胶剂、软膏剂、洗剂、乳液、糊剂、霜剂、泡沫、摩丝、液体、冲洗剂、灌胃剂(garage)、喷雾剂、混悬剂、分散体、鼻喷雾剂和气雾剂的制剂。在某些实施方案中，制剂包含一种或多种赋形剂以提供所需的形式和所需的粘度、流动性或其他物理或化学特性，以用于有效施加、覆盖和附着至皮肤。

在某些实施方案中，本发明的人源蓝黑紫色杆菌被干燥或脱水。干燥可以通过标准实践方法来完成，并且可以选自诸如冻干、喷雾干燥或冷冻干燥的方法。干燥的人源蓝黑紫色杆菌的再水合产生了至少20％的活细菌、至少30％的活细菌、至少50％的活细菌。

本文所公开的组合物是这样的组合物，其中所述组合物在室温下至少30％有活力达至少三十天。还公开了至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％有活力达至少30天、60天、90天、120天、150天、180天或至少360天的组合物。

在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物是合成组合物。在一些实施方案中，组合物是化妆品组合物。在一些实施方案中，组合物是益生性组合物。

本文所公开的组合物可以以包含一种或多种赋形剂的制剂呈现，以改善保质期、施加、皮肤渗透和治疗效应中的任何一者或多者。在一些实施方案中，赋形剂对于改善保质期、施加、皮肤渗透和治疗效应中的任何一者或多者是必要的。

本文所公开的组合物可以呈局部剂型，其中所述局部剂型提供至表面诸如皮肤、指甲、毛发和/或粘膜的容易施加。该表面可以是与受试者接触的表面。

在某些实施方案中，本文所述的紫色杆菌属益生性组合物经配制以用于口服摄入。口服摄入形式可以是丸剂、片剂、胶囊剂、糊剂、液体悬浮液、胶体，或者与各种食物，诸如糖果、咀嚼物、酸奶、牛奶、白干酪或非基于乳制品的或乳糖减少的替代品混合。所述制剂可包含改善可食用组合物的风味、气味或质地的附加非活性成分。所述制剂还可包含粘合剂、包封膜或保持保质期和生物利用度的赋形剂。

乳液可以描述为一种液体以小球形式分布在第二液体的主体中的制剂。在一些实施方案中，分散的液体是不连续相，并且分散介质是连续相。当油是分散的液体并且水溶液是连续相时，乳液被称为水包油乳液，而当水或水溶液是分散相并且油或油质物质是连续相时，乳液被称为油包水乳液。油相可以至少部分由推进剂，诸如HFA推进剂组成。油相和水相中的一者或两者可包含一种或多种表面活性剂、乳化剂、乳液稳定剂、缓冲剂和其他赋形剂。优选的赋形剂包括表面活性剂，尤其是非离子表面活性剂；乳化剂，尤其是乳化蜡；和液体非挥发性非水材料，特别是二醇诸如丙二醇。油相可包含其他医药上批准的油性赋形剂。例如，诸如羟基化蓖麻油或芝麻油的材料可以在油相中用作表面活性剂或乳化剂。

洗剂可以描述为低至中等粘度的液体制剂。洗剂可包含通过使用悬浮剂和分散剂而可溶于分散介质中的细粉末物质。或者，洗剂可具有不可与媒介物混溶的分散相液体物质，并且通常借助于乳化剂或其他合适的稳定剂分散。在一个实施方案中，洗剂是粘度介于100厘沲与1000厘沲之间的乳液形式。洗剂的流动性允许在宽表面积上快速和均匀地施加。洗剂通常旨在在皮肤上干燥，从而在皮肤表面上留下其药物组分的薄涂层。

霜剂可描述为“水包油型”或“油包水型”的粘性液体或半固体乳液。霜剂可含有乳化剂和/或其他稳定剂。在一个实施方案中，制剂是粘度大于1000厘沲，通常在20,000-50,000厘沲范围内的霜剂形式。霜剂往往是比软膏剂更时间优选的，因为它们通常更容易涂抹并且更容易去除。

霜剂与洗剂之间的基本区别在于粘度，粘度取决于各种油的量/使用和用于制备制剂的水的百分比。霜剂通常比洗剂更稠，可具有多种用途，并且往往使用更多不同的油/黄油，具体取决于对皮肤的期望效应。在霜剂制剂中，水基百分比是约60-75％并且油基是总量的约20-30％，其中其他百分比是乳化剂、防腐剂和添加剂，总量为100％。

软膏剂可以描述为含有软膏剂基质和任选的一种或多种本公开的活性剂的半固体制备物。合适的软膏剂基质的示例包括烃基质(例如，矿脂、白矿脂、黄色软膏和矿物油)；吸收基质(亲水c、无水羊毛脂、羊毛脂和冷霜)；水可去除的基质(例如，亲水性软膏)和水溶性基质(例如，聚乙二醇软膏)。糊剂与软膏剂的不同之处通常在于它们含有更大百分比的固体。糊剂通常比用相同组分制备的软膏剂更具吸收性并且更不油腻。

凝胶可以描述为半固体体系，所述半固体体系包含小分子或大分子在液体媒介物中的分散体，该分散体通过溶于或悬浮于液体媒介物中的增稠剂或聚合材料的作用而变成半固体。液体可包含亲脂性组分、水性组分或两者。一些乳液可以是凝胶或者包含凝胶组分。然而，一些凝胶不是乳液，因为它们不包含不可混溶组分的均质共混物。合适的胶凝剂包括但不限于改性纤维素，诸如羟丙基纤维素和羟乙基纤维素；卡波姆均聚物和共聚物；以及它们的组合。液体媒介物中合适的溶剂包括但不限于二甘醇单乙醚；烯烃二醇，诸如丙二醇；二甲基异山梨醇；醇类，诸如异丙醇和乙醇。溶剂通常根据其溶解药物的能力来选择。也可以加入改善制剂的皮肤感觉和/或润肤性的其他添加剂。此类添加剂的示例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、C12-C15烷基苯甲酸酯、矿物油、角鲨烷、环甲硅酮、癸酸/辛酸甘油三酯，以及它们的组合。

泡沫可以描述为乳液与气态推进剂的组合。气态推进剂主要由氢氟烷烃(HFA)组成。合适的推进剂包括HFA，诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227)，但是这些氢氟烷烃的混合物和掺和物以及目前批准或可能批准用于医疗用途的其他HFA也是合适的。推进剂优选地不是可在喷涂期间产生易燃或易爆蒸气的烃推进剂气体。此外，所述组合物优选地不含在使用期间可产生易燃或易爆蒸气的挥发性醇。

润肤剂可被描述为软化或舒缓皮肤的外施加剂，并且通常是在本领域中已知的，并且在药典，诸如“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版，PharmaceuticalPress,2003中列出。在某些实施方案中，润肤剂是扁桃仁油、蓖麻油、长角豆提取物、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、胆固醇、棉籽油、环甲硅酮、乙二醇棕榈酸硬脂酸酯、甘油、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、羊毛脂、卵磷脂、轻矿物油、中链甘油三酯、矿物油和羊毛脂醇、矿脂、矿脂和羊毛脂醇、大豆油、淀粉、硬脂醇、葵花油、木糖醇，以及它们的组合。在一个实施方案中，润肤剂是硬脂酸乙基己酯和棕榈酸乙基己酯。

表面活性剂是降低表面张力并由此提高产品的乳化、发泡、分散、铺展和润湿特性的表面活性剂。在某些实施方案中，合适的非离子表面活性剂包括乳化蜡、单油酸甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨醇酯、脱水山梨醇酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、环糊精、单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆、聚维酮，以及它们的组合。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是硬脂醇。

乳化剂是表面活性物质，所述表面活性物质促进一种液体在另一种液体中的悬浮并且促进油和水的稳定混合物或乳液的形成。在某些实施方案中，乳化剂是金属皂、某些动物和植物油，以及各种极性化合物。合适的乳化剂包括阿拉伯树胶、阴离子乳化蜡、硬脂酸钙、卡波姆、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、乙二醇棕榈酸酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羊毛脂、含水羊毛脂醇、卵磷脂、中链甘油三酯、甲基纤维素、矿物油和羊毛脂醇、磷酸二氢钠、单乙醇胺、非离子乳化蜡、油酸、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、藻酸丙二醇酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、脱水柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、脱水山梨醇酯、硬脂酸、葵花油、黄蓍胶、三乙醇胺、黄原胶，以及它们的组合。在一个实施方案中，乳化剂是硬脂酸甘油酯。在一个实施方案中，乳化剂是丙三醇(glycerol)。在一个实施方案中，乳化剂是甘油(glycerin)。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物经配制以施用至受试者的头皮。在一些实施方案中，组合物经配制以用作选自洗发剂、护发素、摩丝、凝胶剂和喷雾剂的产品。此类组合物可用于治疗脂溢性皮炎。用此类组合物治疗脂溢性皮炎可以导致选自头皮屑和乳痂的症状减轻。然而，本文所公开的组合物可用于治疗除头皮以外的身体其他区域处的脂溢性皮炎。其他区域的非限制性示例包括胸部、胃部、皮肤褶皱、手臂、腿部、腹股沟区域和乳房下方。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物包含缓冲剂，其中所述缓冲剂控制组合物的pH。优选地，所述缓冲剂将组合物保持在约4的pH至约7.5的pH，约4的pH至约7的pH，以及约5的pH至约7的pH。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物经配制以提供或维持所需的皮肤pH。在一些实施方案中，期望的皮肤pH介于约4.5与约6.5之间。在一些实施方案中，期望的皮肤pH介于约5与约6之间。在一些实施方案中，期望的皮肤pH是约5.5。在一些实施方案中，本文所公开的组合物用皮肤pH调节剂配制。pH调节剂的非限制性示例包括水杨酸、乙醇酸、三氯乙酸、壬二酸、乳酸、天冬氨酸、盐酸盐、硬脂酸、硬脂酸甘油酯、棕榈酸鲸蜡酯、磷酸脲和生育酚乙酸酯。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物经配制以提供更多的氧气至皮肤。在一些实施方案中，本文所公开的组合物经配制以提供更多的氧气暴露至皮肤。在一些实施方案中，本文所公开的组合物经配制以提供更多的氧气扩散至皮肤。在一些实施方案中，本文所公开的组合物经配制以提供更多的通过皮肤的氧气扩散。在一些实施方案中，本文所公开的组合物用提供更多的氧气至皮肤的试剂配制。在一些实施方案中，本文所公开的组合物与提供更多的氧气至皮肤的试剂一起使用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物在提供更多的氧气至皮肤的试剂之前使用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物在提供更多的氧气至皮肤的试剂之后使用。提供更多的氧气至皮肤的试剂的非限制性示例是叶绿素。

防腐剂可用来防止真菌和微生物的生长。合适的抗真菌剂和抗微生物剂包括但不限于苯甲酸、尼泊金丁酯、尼泊金乙酯、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇和硫柳汞。在一个实施方案中，选择有效防止真菌生长的防腐剂的浓度，而不影响组合物用于其在局部施用时的预期目的的有效性。

制剂中的赋形剂根据预期的制剂类型进行选择。在某些实施方案中，赋形剂包括明胶、酪蛋白、卵磷脂、阿拉伯树胶、胆固醇、黄蓍胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇、聚西托醇乳化蜡、脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、非晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、糖和淀粉。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物用丙三醇配制。在一些情况下，组合物中的细菌菌株发酵丙三醇，从而产生短链脂肪酸。短链脂肪酸的非限制性示例包括乙酸、乳酸和丙酸。在一些情况下，在甘油存在下生长的人源蓝黑紫色杆菌增强了紫色杆菌素或一种或多种抗微生物代谢物的产生。

渗透增强剂经常用于促进药物跨皮肤，特别是跨角质层的经皮递送。一些渗透促进剂引起真皮刺激、真皮毒性和真皮过敏。然而，更常用的渗透促进剂包括脲、(羰基二酰胺)、酰亚胺脲、N,N-二乙基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷、1-十二烷基-氮杂环庚烷-2-酮、硫代乙醇酸钙(calcium thioglycate)、2-吡咯烷、N,N-二乙基-间甲苯酰胺、油酸及其酯衍生物(诸如单油酸甲酯、单油酸乙酯、单油酸丙酯、单油酸异丙酯、单油酸丁酯、单油酸乙烯酯和单油酸甘油酯)、脱水山梨糖醇酯(诸如单月桂酸脱水山梨糖醇酯和单油酸脱水山梨糖醇酯)、其他脂肪酸酯(诸如月桂酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、己二酸二异丙酯、单月桂酸丙二醇酯、单油酸丙二醇酯)和非离子洗涤剂(诸如

该组合物可以配制成包含特定浓度的紫色杆菌属益生性组合物。例如，组合物可包含一定量的益生菌，使得可以以有效量递送微生物。在某些实施方案中，所递送的益生菌的量是每单位剂量至少1×10^3CFU、1×10^4CFU、1×10^5CFU、1×10^6CFU、1×10^7CFU、1×10^8CFU、1×10^9CFU、1×10^10CFU。所述组合物可以用相对于所述组合物的总重量至少约0.0001重量％(以干重表示)、约0.0001重量％至约99重量％、约0.001重量％至约90重量％、约0.01重量％至约80重量％和约0.1重量％至约70重量％的比例的紫色杆菌属益生菌配制。一般来说，旨在局部施用的组合物包含至少每克载剂1×10^3个、1×10^4个、1×10^5个、1×10^6个、1×10^7个、1×10^8个、1×10^9个、1×10^10个个微生物，或针对无活性或死亡微生物或针对细菌级分或针对所产生的代谢物计算的等同剂量。

本文所公开的微生物可以以每单位剂量至少约1×10^2CFU至约1×10^20CFU的有效量递送。在必须局部施用的组合物的特定情况下，可以调节每种细菌菌株和/或对应级分和/或代谢物的浓度，以对应于约1×10^5CFU/剂至约1×10^12CFU/剂的范围内的剂量(表示为细菌当量)。

本文所公开的用于局部施加的组合物通常包含约1×10^2CFU/g至约1×10^15CFU/g、约1×10^5CFU/g至约1×10^12CFU/g、或约1×10^6CFU/g至约10×10^12CFU/g的细菌。

在某些实施方案中，本文所公开的组合物经配制以递送每平方厘米皮肤至少10^6个微生物。在某些实施方案中，组合物经配制以递送每平方厘米皮肤至少10^7个微生物。在某些实施方案中，组合物经配制以递送每平方厘米皮肤至少10^8个微生物。在某些实施方案中，组合物经配制以递送每平方厘米皮肤至少10^9个微生物。在某些实施方案中，组合物经配制以递送每平方厘米皮肤少于10^9个微生物。在某些实施方案中，组合物经配制以递送每平方厘米皮肤少于10^8个微生物。在某些实施方案中，组合物经配制以递送每平方厘米皮肤少于10^7个微生物。在某些实施方案中，组合物经配制以递送每平方厘米皮肤介于约10^7个与10^8个之间的微生物。在某些实施方案中，组合物经配制以递送介于每平方厘米皮肤约10^6个微生物与每平方厘米皮肤约10^10个微生物之间。在某些实施方案中，组合物经配制以递送介于每平方厘米皮肤约10^6个微生物与每平方厘米皮肤约10^9个微生物之间。在某些实施方案中，组合物经配制以递送介于每平方厘米皮肤约10^7个微生物与每平方厘米皮肤约10^10个微生物之间。在某些实施方案中，组合物经配制以递送介于每平方厘米皮肤约10^7个微生物与每平方厘米皮肤约10^9个微生物之间。

在某些实施方案中，本文所公开的组合物以每毫升约10^5个微生物至每毫升约10^12个微生物的浓度配制。在某些实施方案中，本文所公开的组合物以每毫升约10^6个微生物的浓度配制。在某些实施方案中，本文所公开的组合物以每毫升约10^7个微生物的浓度配制。在某些实施方案中，本文所公开的组合物以每毫升约10^8个微生物的浓度配制。在某些实施方案中，本文所公开的组合物以每毫升约10^9个微生物的浓度配制。在某些实施方案中，本文所公开的组合物以每毫升约10^10个微生物的浓度配制。

在某些实施方案中，本文所公开的用于局部或口服使用的组合物包含生物稳定性化合物，包括但不限于碳水化合物，诸如海藻糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖和糖醇；和/或冷冻保存剂，诸如甘油、无牛培养基(例如，胰酶大豆肉汤)、乳清蛋白、NaCl、磷酸盐缓冲液、MgCl、冻干细菌或其他无活性/灭活的细菌。

在配制后，本文所公开的组合物可以以适合递送和由最终用户使用的方式包装。在一个实施方案中，将组合物放入合适的分配器中并运送给最终用户。最终容器的示例可包括泵瓶、挤压瓶、罐、试管、胶囊或小瓶。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物可以在包装前添加至涂药器中。涂药器的非限制性示例包括棉垫、聚酯垫、Q尖端、海绵和刷子。在一些实施方案中，涂药器被放置在包装中。包装的非限制性示例包括袋子和箔或蜡衬里的纸包。包装的内部可以是无菌的。在一些实施方案中，在密封之前用真空去除包装中的空气。在一些实施方案中，包装是热密封的。在一些实施方案中，包装是用粘合剂密封的。

在另一个实施方案中，本文所公开的组合物通过冻干、冷冻干燥或喷雾干燥进行脱水或干燥，以便在施用至皮肤之前进行重构。在一个实施方案中，用一种或多种赋形剂诸如甘油或其他糖醇进行冻干、冷冻干燥或喷雾干燥，以提高选定的、转化的或工程化的细菌的保质期。在一个实施方案中，制剂组合物不包含海藻糖(α-D-吡喃葡萄糖基-1,1-α-D-吡喃葡萄糖)。在一些实施方案中，组合物不必冷冻。

本文所公开的组合物可以包装在一个或多个容器中。例如，单个瓶子、试管、容器或胶囊可以分成两个相等或不相等的部分，其中一个部分包含包装形式(干燥、冷冻干燥等)的细菌，另一部分包含活化材料，所述活化材料可以是液体或凝胶。单个瓶子或容器可以被设计成使得最终用户可以用施加到容器上的单个力来分配两个容器部分中的全部或部分内容物，以将选定的、转化的或工程化的细菌和活化材料分配到皮肤或其他表面上。试剂盒也可以是包含两个或多个容器的形式，一个容器具有选定的、转化的或工程化的细菌群体，另一个容器具有用于与选定的、转化的或工程化的细菌群体掺和的制剂。在另一个示例中，两个或更多个容器，一个容器具有选定的、转化的或工程化的细菌群体，另一个容器具有未选定、未转化或未工程化的天然非病原皮肤细菌，第三容器具有用于与选定的、转化的或工程化的细菌群体掺和的制剂。在另一个示例中，组成单个瓶子的两个或更多个容器具有一个连接至两个独立管的泵，每个独立管从不同的腔室排出。所述试剂盒还可包括一种或多种补充产品，诸如肥皂、具有一定pH的沐浴露或保湿洗剂、洗剂或霜剂。在另一个实施方案中，补充产品是益生性的。补充产品可包含任何有益于原始产品的活性并增强其活性以实现持久功效的化合物。另一种设想的包装是这样的包装，其中选定的、转化的或工程化的细菌群体保持为绷带或膜上的一层，该层与将允许细菌活化并且任选地还可以限制繁殖/生长因子的第二层绷带/膜组合。在另一个实施方案中，最终产品冷藏存储，其中细菌处于其活性状态。在另一个实施方案中，细菌存储在水溶性纤维素小珠粒中。珠粒可以混合在任何溶液，诸如防晒剂、保湿剂、沐浴露或肥皂中。

本文公开了为用于局部施加的水性制剂形式的包含人源蓝黑紫色杆菌的紫色杆菌属益生性组合物。在一些实施方案中，益生性组合物经配制以用于施加至皮肤。在一些实施方案中，益生性组合物经配制以用于施加至粘膜。

在一些实施方案中，紫色杆菌属益生性组合物是与一种或多种附加活性剂共配制的。益生性组合物可以与一种或多种附加抗微生物剂共配制，如在组合小节中所详述的。简而言之，附加抗微生物剂可以是抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂，或这些试剂中的任何试剂的组合。

在一些实施方案中，紫色杆菌属益生性组合物与一种或多种赋予附加益处的附加活性剂，诸如缓解瘙痒、疼痛、变色或其他非期望效应的试剂共配制。

在一些实施方案中，紫色杆菌属益生性组合物还包含附加微生物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少两种、三种或四种不同的人源蓝黑紫色杆菌，其中至少一种人源蓝黑紫色杆菌来源于人类宿主。在一些实施方案中，紫色杆菌属益生菌还包含乳杆菌属物种或乳球菌属物种。在一些实施方案中，紫色杆菌属益生菌还包含经常在人类皮肤上发现的良性或有益真菌菌株或丙酸杆菌属(Propionibacterium)的良性或有益菌株。

在一些实施方案中，根据本发明的呈乳液组合物形式的紫色杆菌属化妆品组合物尤其有效。在这种情况下，乳液可以是水包油乳液、油包水乳液、水包油包水乳液或油包水包油乳液的形式。或者，本发明的化妆品组合物也可以非水组合物的形式使用。非水组合物的形式例示为固体、半固体、压制的、摩丝、粉末和棒形式。在本发明中，“非水组合物”是指不用水配制的组合物。

本发明的人源蓝黑紫色杆菌组合物可以以联合疗法模式与其他试剂一起施用，所述其他试剂包括抗微生物剂、益生菌、后生元和益生元。施用可以是在数小时或数天的时段内连续的，或者是同时的。

在一个实施方案中，细菌组合物被包含在与一种或多种抗微生物剂的联合疗法中，所述一种或多种抗微生物剂包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和抗寄生虫剂。

抗细菌剂可以包括头孢菌素类抗生素(头孢氨苄、头孢呋辛、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢金素、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯和头孢吡普)；氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星、左氧氟沙星、氟氯仙、加替沙星、莫西沙星和诺氟沙星)；四环素类抗生素(四环素、米诺环素、土霉素和强力霉素)；青霉素类抗生素(阿莫西林、氨苄西林、盘尼西林V、双氯西林、羧苄西林、万古霉素和甲氧西林)；和碳青霉烯类抗生素(厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁和美罗培南)。

抗病毒剂可包括阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、安普那韦、阿扎那韦、西多福韦、地瑞那韦、地拉韦啶、地达诺新、廿二烷醇、依法韦仑、埃替拉韦(Elvitegravir)、恩曲他滨、恩夫韦地、依曲韦林、泛昔洛韦、膦甲酸钠(Foscarnet)、福米韦森、更昔洛韦、茚地那韦、碘苷、拉米夫定、洛匹那韦马拉韦罗、MK-2048、奈非那韦、奈韦拉平、喷昔洛韦、雷特格韦、利匹韦林、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、替诺福韦三氟尿苷、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、阿糖腺苷、伊巴他滨、金刚烷胺、奥司他韦、金刚烷乙胺(Rimantidine)、替普拉那韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。

抗真菌化合物的示例包括但不限于多烯抗真菌药，诸如纳他霉素、龟裂霉素、菲律宾菌素、制霉菌素、两性霉素B、杀假丝菌素(candicin)和哈霉素；咪唑类抗真菌药，诸如咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、奥莫康唑、联苯苄唑、布康唑、芬替康唑、异康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑和噻康唑；三唑类抗真菌药，诸如氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑、雷夫康唑、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑和阿巴康唑；噻唑类抗真菌药，诸如阿巴芬净；烯丙胺类抗真菌药，诸如特比萘芬、萘替芬和布替萘芬；和棘球白素类抗真菌药，诸如阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净。具有抗真菌特性的其他化合物包括但不限于蓼二醛(polygodial)、苯甲酸、环吡酮、托萘酯、十一碳烯酸、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素和卤普罗近。

在一个实施方案中，细菌组合物被包含在与一种或多种皮质类固醇、美沙拉嗪(mesalazine)、美沙拉明(mesalamine)、柳氮磺胺吡啶、柳氮磺胺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A、巯基嘌呤、硫唑嘌呤、强的松、氨甲蝶呤、抗组胺药、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯、用于鼻炎的抗胆碱能药物、抗胆碱能解充血药、肥大细胞稳定剂、单克隆抗IgE抗体、疫苗以及它们的组合的联合疗法中。

本文所述的方法和组合物可用于治疗和/或预防由对人源蓝黑紫色杆菌产生的代谢物敏感的寄生微生物的生长引起的感染。这些微生物可以是细菌、病毒、酵母或真菌。

在一个实施方案中，感染是甲癣。在一个实施方案中，感染是足癣。在一个实施方案中，感染是特应性皮炎。在一个实施方案中，感染是脓疱病。在一个实施方案中，感染是皮肤或软组织的感染。

在一个实施方案中，感染是由皮肤真菌引起的。在一个实施方案中，感染是由马拉色氏霉菌属(Malassezia)物种引起的。在一个实施方案中，感染是由毛癣菌属物种引起的。在一个实施方案中，感染是由葡萄球菌属物种引起的。在一个实施方案中，感染是由红色毛癣菌引起的。在一个实施方案中，感染是由金黄色酿脓葡萄球菌引起的。在一个实施方案中，感染是由革兰氏阳性细菌引起的。

在施用本发明的组合物之前，受试者或患者可以任选地具有预处理方案来使皮肤准备好接受所述细菌组合物。在某些实施方案中，预处理方案是可取的，诸如当患者患有高复原力病原体的急性感染时。在其他实施方案中，预处理方案是完全任选的，诸如当引起感染的病原体没有复原力时，或者患者已经患有急性感染，所述急性感染已经被成功治疗，但是医生担心感染可能复发时。在这些情况下，预处理方案可以增强细菌组合物影响患者的微生物群系的能力。

作为使患者准备好施用微生物生态系统的一种方式，可以施用至少一种抗生素或抗真菌剂来改变患者身上的微生物。这可以口服或局部施加。

如果患者已经接受了用于治疗感染的抗生素，或者如果患者已经接受了作为特定预处理方案的一部分的抗生素，则在一个实施方案中，应该在足够长的时间内停用抗生素，以允许在施用细菌组合物之前使抗生素在皮肤上的浓度显著降低。在一个实施方案中，抗生素可以在施用细菌组合物前1天、2天或3天停用。在一个实施方案中，抗生素可以在施用细菌组合物之前停用3个、4个、5个、6个或7个抗生素半衰期。在另一个实施方案中，抗生素可经选择使得细菌组合物中的成分具有比在皮肤上的抗生素浓度更高的MIC50。

细菌组合物或组合物中要素的MIC50可通过本领域熟知的方法Reller等人，Antimicrobial Susceptibility Testing:A Review of General Principles andContemporary Practices,Clinical Infectious Diseases49(11):1749-1755(2009)来测定。在此类实施方案中，抗生素施用与细菌组合物施用之间的附加时间不是必需的。如果预处理方案是急性感染的治疗的一部分，则抗生素可经选择为使得感染对抗生素敏感，但是细菌组合物中的成分对抗生素不敏感。

在一些实施方案中，在施加紫色杆菌属益生性组合物之前，用去污剂物质预处理受试者的皮肤以减少皮肤病原体的量。

在一些实施方案中，将紫色杆菌属益生菌用物质预处理以增加有益代谢物的产量。在一些实施方案中，将益生菌在益生元的存在下孵育以增加紫色杆菌素，诸如甘油或色氨酸的产量。

制造方法

本文所述的组合物中的任一者，包括药物组合物、制品和包含所述组合物的食品或家用产品，可包含任何形式，例如水溶液形式(诸如溶液或悬浮液)、以半固体形式、粉末形式或冻干形式包埋的细菌菌株。在一些实施方案中，将组合物或组合物的细菌菌株冻干。在一些实施方案中，将组合物中的细菌菌株的子集冻干。冻干组合物，特别是包含细菌的组合物的方法是本领域中众所周知的。参见例如美国专利号3,261,761；4,205,132；PCT公开案WO 2014/029578和WO 2012/098358，这些专利的全部内容以引用方式并入。细菌可以作为组合冻干，和/或细菌可以单独冻干并在施用前组合。细菌菌株可以在与另一种细菌菌株组合之前与药物赋形剂组合，或者可以将多种冻干细菌在处于冻干形式的同时进行组合，并且细菌混合物一旦组合就可以随后与药物赋形剂组合。在一些实施方案中，细菌菌株是冻干饼。在一些实施方案中，包含一种或多种细菌菌株的组合物是冻干饼。

所述组合物的细菌菌株可以使用本领域众所周知的发酵技术制造。在一些实施方案中，活性成分是使用厌氧发酵罐制造的，所述厌氧发酵罐可以支持厌氧细菌物种的快速生长。厌氧发酵罐可以是例如搅拌罐反应器或一次性波生物反应器。培养基诸如BL培养基和EG培养基，或类似版本的不含动物组分的培养基，可用于支持细菌物种的生长。细菌产物可以通过传统技术(诸如离心和过滤)从发酵液中纯化和浓缩，并且可以任选地通过本领域众所周知的技术干燥和冻干。

在一些实施方案中，细菌菌株的组合物可经配制以用于作为药物组合物施用。如本文所用的术语“药物组合物”是指由混合或组合至少一种活性成分(诸如本文所述的任何两种或更多种纯化的细菌菌株)与一种或多种无活性成分而产生的产品，所述无活性成分可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。

“可接受的”赋形剂是指必须可与活性成分相容且对施用于的受试者无害的赋形剂。在一些实施方案中，基于组合物的预期施用途径选择药学上可接受的赋形剂，例如用于口服或鼻内施用的组合物可包含与用于直肠施用的组合物不同的药学上可接受的赋形剂。赋形剂的示例包括无菌水、生理盐水、溶剂、基础材料、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、芳香剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂、稀释剂、张力调节剂、舒缓剂(soothing agent)、填充剂、崩解剂、缓冲剂、包衣剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、增稠剂和增溶剂。

本发明的药物组合物可以根据本领域中众所周知和常规实践的方法制备(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.，第20版，2000)。本文所述的药物组合物还可包含冻干制剂或水溶液形式的任何载剂或稳定剂。可接受的赋形剂、载剂或稳定剂可包括例如缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、聚合物、螯合剂和/或表面活性剂。药物组合物优选地在GMP条件下制造。该药物组合物可以口服地、经鼻地或肠胃外地使用，例如以胶囊、片剂、丸剂、囊剂、液体、粉末剂、颗粒剂、细颗粒剂、膜包衣制备物、微丸、锭剂、舌下制备物、可咀嚼物、经颊制备物、糊剂、糖浆剂、混悬剂、酏剂、乳液、搽剂、软膏剂、膏药、巴布剂、经皮吸收体系、洗剂、吸入剂、气雾剂、注射剂、栓剂等形式使用。

制品

在一些实施方案中，将人源蓝黑紫色杆菌配制成制品，例如用人源蓝黑紫色杆菌或人源蓝黑紫色杆菌的后生元或裂解物或代谢物浸渍的物质。

在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌与布相关联。布通常指适于制成衣服的柔性材料，例如，具有足够的材料强度以承受穿着者的日常运动。布可以是纤维的、机织的或针织的；它可以由天然存在的材料或合成材料制成。示例性的布材料包括棉、亚麻、羊毛、苎麻、蚕丝、牛仔布、皮革、尼龙、聚酯和氨纶，以及它们的共混物。

在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌与纱线相关联。纱线通常指的是适用于针织或机织的长而细的纺成柔软材料。纱线可以由例如羊毛、棉、聚酯以及它们的共混物制成。

在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌与缝线相关联。缝线一般是指适于缝纫的长而细的纺成弹性材料。缝线的直径通常比纱线更细。缝线可以由例如棉、聚酯、尼龙、蚕丝以及它们的共混物制成。

衣物制品，诸如鞋、鞋垫、睡衣、运动鞋、皮带、帽子、衬衫、内衣、运动服、头盔、毛巾、手套、袜子、绷带等，也可以用人源蓝黑紫色杆菌处理。床上用品，包括床单、枕头、枕套和毯子也可以用紫色杆菌属处理。在一些实施方案中，某一时间段内无法洗涤的皮肤区域也可以与紫色杆菌属接触。例如，在愈合过程期间固定化受伤肢体的矫形铸件(orthopediccast)中包裹的皮肤，以及伤口附近必须保持干燥才能正确愈合的区域，诸如缝合的伤口，可受益于与紫色杆菌属接触。

在一些方面中，本公开提供了一种可穿戴制品，所述可穿戴制品包含如本文所述的人源蓝黑紫色杆菌。可穿戴制品可以是能够以不妨碍行走的方式与用户的身体紧密相关联的轻质制品。可穿戴制品的示例包括手表、腕带、头带、发圈、发网、浴帽、帽子、假发和珠宝。本文所述的包含人源蓝黑紫色杆菌的可穿戴制品可以例如以一定浓度提供对皮肤疾患的治疗或预防、对与低亚硝酸盐水平相关联的疾病或病症的治疗或预防、对体臭的治疗或预防、向受试者提供一氧化氮的治疗或抑制微生物生长的治疗中的一者或多者。

在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌与旨在接触毛发的产品，例如刷子、梳子、洗发剂、护发素、头带、发圈、发网、浴帽、帽子和假发相关联。接触人受试者的表面的制品，诸如尿布，可与本发明的紫色杆菌属相关联。

在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌与家用物品相关联，否则所述家用物品可能充当人类皮肤病原体的贮存器。在一些实施方案中，浴帘、浴室足垫、淋浴垫或排水瓦管浸渍有紫色杆菌属或人源蓝黑紫色杆菌的后生元或裂解物或代谢物。

在一些实施方案中，人源蓝黑紫色杆菌与家庭或工业清洁物质，例如旨在用于清洁健身房淋浴的清洁物质相关联。

在一些实施方案中，包装包含人源蓝黑紫色杆菌的产品。包装可用于压实产品或保护产品免受损坏、弄脏或降解。包装可包括例如塑料、纸、硬纸板或木材。在一些实施方案中，包装是细菌不可渗透的。在一些实施方案中，包装是氧气和/或二氧化碳可渗透的。

序列表

7.实施例

7.1.实施例1：人蓝黑紫色杆菌的分离

材料与方法

用于生物勘探的样本

样本是来源于各种来源并从各种来源收集的。使用eSwab管(Fisher，货物编号23-600-900)遵循标准擦洗/擦拭工序从18-25岁的年轻健康成人受试者收集皮肤微生物样本。从每个受试者的头皮、前额、鼻子、肘前窝、手掌、足跟和趾蹼空间收集样本。

从农贸市场和农场获得农产品样本。

菌株分离

将人类皮肤样本直接处理，或者用DMSO作为冷冻保护剂在-80℃存储，然后在室温下解冻以供进行处理。将皮肤样本在稀释至每个平板100-300个菌落的程度后，按照标准微生物实践铺板到供应有1％甘油的BHI和R2A琼脂平板上。将平板在环境温度下孵育3-5天，并用紫色颜料目视检查细菌菌落。

首先使用以乙醇擦拭简单清洁的一把剪刀将农产品样本切碎成较小的块。将约50克切碎的块与10ml无菌1xPBS缓冲液在预装有20-30个无菌5mm玻璃珠的50ml离心管中混合，并以最高速度涡旋5分钟。在涡旋后，让试管静置5-10分钟以让植物碎片沉降到底部。使混合物穿过40μm细胞过滤器。将100μl经过滤的液体在稀释至每平板100-300个菌落的程度后铺板到具有1％甘油的BHI和R2A平板上。将平板在环境温度下孵育3-5天，并用紫色颜料目视检查细菌菌落。

蓝黑紫色杆菌菌株的分子鉴定

将所有紫色菌落通过传代培养纯化，并通过16S rRNA测序证实为蓝黑紫色杆菌菌株。从纯化的紫色菌落中提取DNA，并使用标准27F/1492R引物对用热循环仪进行扩增。在提交以进行桑格测序之前，在E-凝胶上检查PCR产物。通过对照NCBI数据库搜索所获得的序列来确定分类信息。

结果、解释和结论

从35名受试者收集约700个皮肤样本。来自两名单独受试者的两个样本分别产生了一个和超过50个紫色菌落(图1)。在R2A平板上从足跟样本中分离出了一个紫色菌落，并确认为蓝黑紫色杆菌(图1，小图A)。另一个前额样本在BHI琼脂平板上产生了超过50个紫色菌落(图1，小图B)。分子鉴定表明，随机选择的5个紫色菌落均为蓝黑紫色杆菌。

处理了几种农产品样本的幼苗，包括萝卜、大蒜、菠菜、罗勒、甜菜、芦笋、香葱、番茄、唐莴苣、生菜和胡椒。例如，从萝卜样本中分离出了三个紫色菌落(图1，小图C)。

7.2.实施例2：遗传研究

总结

为了调查人皮肤上蓝黑紫色杆菌的盛行率，采用定量PCR(qPCR)测定对从42名健康年轻成人收集的约700份皮肤微生物样本进行筛选。此外，对从9名健康年轻成人收集的约156个皮肤微生物样本执行鸟枪法测序。结果表明，通过qPCR发现19％的受试者的皮肤上有蓝黑紫色杆菌，并且通过鸟枪法测序发现所有9名受试者的皮肤上均有蓝黑紫色杆菌。鸟枪法测序分析还显示，在多个解剖部位上和多次样本收集访问时检测到了蓝黑紫色杆菌，表明蓝黑紫色杆菌除了在土壤、两栖动物和植物中被鉴定出之外，还普遍存在于人类皮肤上。

本文所公开的蓝黑紫色杆菌菌株的遗传分析和分子进化研究以及具有所公布的基因组序列的菌株表明，蓝黑紫色杆菌菌株分为至少四个不同的亚组，并且每个亚组由从包括土壤、植物、两栖动物和人类皮肤在内的各种来源分离的蓝黑紫色杆菌菌株组成。

材料和方法

来自人皮肤微生物样本的蓝黑紫色杆菌的qPCR筛选

按照使用说明书，使用SensiFAST SYBR No-ROX试剂盒(Bioline)在CFX实时PCR检测系统(BioRad)上以一式两份的10μl反应执行蓝黑紫色杆菌的分子筛选。使用两组引物对，即紫色杆菌属特异性引物对(Janthino2F2，GCACGGAAGTGACCAAAAA和Janthino2R2，ACATGGAGACTTGGGCTTTG)和紫色杆菌素特异性引物对(JlivF，TACCACGAATTGCTGTGCCAGTTG和JlivR，ACACGCTCCAGGTATACGTCTTCA)顺序地进行筛选。

全基因组鸟枪法测序和基因组序列装配

根据使用说明书，使用由Illumina公司制造的Nextera Flex试剂盒，生成每种蓝黑紫色杆菌菌株的鸟枪法测序文库。将鸟枪法文库在HiSeq X上进行汇集和测序。测序读段被自动多路解编成单独的FASTA文件，通过DermBiont的生物信息血分析管线运行，从而产生由经清洁的测序读段装配的基因组。

蓝黑紫色杆菌菌株的核苷酸水平的基因组相似性

通过平均核苷酸鉴定(ANI,https://img.jgi.doe.gov/docs/docs/ANI.pdf)分析运行5种蓝黑紫色杆菌菌株(JL001、JL002、JL004、JL005和JL007)的基因组序列以及几个公布的蓝黑紫色杆菌基因组，以确定相似性和遗传多样性。

蓝黑紫色杆菌基因组序列的系统发生分析

按照使用说明书，使用RAxML包评估蓝黑紫色杆菌菌株的系统发生关系，所述蓝黑紫色杆菌菌株包括本文所述的蓝黑紫色杆菌菌株和具有已公布的基因组序列的菌株。

结果、解释和结论

对从42名健康年轻成人的包括头皮、前额、鼻翼褶皱、肘前窝、手掌、足跟和趾蹼空间在内的不同解剖部位收集的704个皮肤微生物样本进行筛选。qPCR筛查显示使用紫色杆菌属特异性引物对和紫色杆菌素特异性引物对时分别有116个和30个阳性样本(表2)。如所预期的，来自8名单独受试者的8个样本对两个探针组均呈阳性(表2)，表明约19％的所测试受试者的皮肤上有蓝黑紫色杆菌。

表2.来自皮肤微生物样本的蓝黑紫色杆菌的qPCR筛选

为了进一步评估皮肤微生物样本中蓝黑紫色杆菌的盛行率和丰度，对来自3次样本采集访问时9名年轻健康受试者的跨7个解剖位的总共127个皮肤微生物样本执行宏基因组鸟枪法测序。由于鸟枪法测序法的高灵敏度，预期蓝黑紫色杆菌阳性样本的百分比高于qPCR筛查。事实上，并且不令人惊讶的是，所有9名受试者的皮肤样本在多个解剖部位处或多次采样访问时都有蓝黑紫色杆菌(图2)。平均而言，蓝黑紫色杆菌DNA占总皮肤微生物DNA的0.4％，其中在肘前窝和手掌中具有高丰度，而在足区域中具有极低的丰度(图2)。

ANI使用两个基因组之间的最佳命中和倒数最佳命中来估计平均核苷酸同一性(enve-omics.ce.gatech.edu/ani/)。下载8个公布的蓝黑紫色杆菌基因组，并与内部分离的蓝黑紫色杆菌基因组序列进行比较以用于ANI分析。为了进一步评估蓝黑紫色杆菌菌株的进化关系，使用全基因组序列构建所有蓝黑紫色杆菌菌株的系统发生树。存在蓝黑紫色杆菌的至少4个不同亚组(图3)。此外，每个亚组由从包括土壤、植物、两栖动物和人类皮肤在内的各种来源收集的蓝黑紫色杆菌组成(图3)。

7.3.实施例3：益生元的鉴定

使用来自美国加利福尼亚州海沃德市Biolog(Biolog,Hayward,CA,USA)的PM1至PM5 10微生物细胞表型微阵列，我们鉴定出了这样的化合物，所述化合物当用于细菌蓝黑紫色杆菌及其构成产品的制剂、冻干、发酵和/或递送运载工具中时增加了生长速率(表3)和/或针对抑制微生物病原体的功能功效(表4)，所述微生物病原体包括但不限于细菌感染，诸如葡萄球菌属、假单胞菌属、肠球菌属；真菌病原体，包括但不限于毛癣菌属、马拉色氏霉菌属、假丝酵母属；DNA和RNA病毒，包括但不限于脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、甲型肝炎、轮状病毒、腺病毒、H1N1、冠状病毒和甲型流感病毒。

*在27℃在10小时和11小时时间点比标准培养基对照大0.1OD单位或更高。

表4.用于增强抵抗真菌或细菌病原体的功能的组分

*与概述的在27℃在24小时和七天处的标准条件相比，抑制区的直径增加了5％或更多。

紫色杆菌素和灵菌红素的提取和定量在本领域是众所周知的，并且可以使用标准技术完成。

可以通过使用分光光度计测量细菌培养物在580nm和764nm处的吸光度，来定量紫色杆菌素产量。通过从580nm处的值中减去764nm处的值，细菌细胞对吸光度的贡献被去除，并且剩余的值定量了紫色杆菌素水平。

灵菌红素的水平可以类似地通过在酸化的乙醇中提取色素来测量。酸化的乙醇中的灵菌红素显示出535nm的特征波长。在孵育结束时测量600nm处的吸光度后，灵菌红素的估计值可以表示为单位/细胞。

7.4.实施例4：制造

总结

使蓝黑紫色杆菌DB02473在5L规模的发酵罐中生长。发酵罐是从14-15小时的旧摇瓶培养接种物接种的，并通过测量600nm处的吸光度来监测生长。无菌地收获发酵罐培养物，并将细胞沉淀重悬于含有冷冻保护剂和稳定剂的制剂缓冲液中，以制备冷冻制剂或冻干制剂。在稀释至10

材料和方法

微生物菌株

红色毛癣菌菌株18754购自ATCC，并根据使用说明书进行维护。蓝黑紫色杆菌菌株JL007低温贮库2在-80℃下以DMSO或甘油作为冷冻保护剂进行存储。金黄色酿脓葡萄球菌菌株25923购自ATCC，并根据使用说明书进行维护。

纯度测定

将用于接种发酵罐的摇瓶培养物和重悬于冷冻保护剂媒介物中的收获的培养物进行稀释，使得100μl的铺板将导致每平板估计100-300个菌落。该估计值基于600nm处的吸光度读数和过去的经验，其中1个OD单位是5×10

活力测定

在收获时，测量600nm处的吸光度并计算CFU/ml，假设1OD单位等于5×10^8CFU/ml。如下所述将一个样本立即铺板，将另一个样本放在冰上带到实验室，并使用拉姆齐测定(参见下文)和葡萄球菌属抗生测定分析红色毛癣菌活性，并铺板以再次计数。此外，然后从收获物中制备3个样本以等于10

拉姆齐体外抗生测定

体外测定是按照由Ramsey等人(2015)报道并由DermBiont优化的工序建立的。简而言之，使用棉签将生长在50％LB-胰蛋白胨水(LB50)中约2×10

与对照相比红色毛癣菌的抑制被称为以mm为单位的菌落大小减少。首先使用ImageJ以像素(直线)为单位测量红色毛癣菌菌落的半径，并基于有盖培养皿的像素测量值将其转换为mm单位。

金黄色酿脓葡萄球菌抗生测定

按照标准实验工序设置体外测定。简而言之，将来自低温贮库(cryostock)的金黄色酿脓葡萄球菌25923划线到BHI琼脂上，并在37℃孵育过夜。使用琼脂平板进行1周内的测定。向3ml BHI培养基接种来自琼脂平板的菌落，并在37℃生长2-3小时。测量600nm处的吸光度并稀释至1×10^7CFU/ml，假设1OD单位等于1×10^9CFU/ml。将200μl的1×10^7CFU/ml加入LB50琼脂平板中，并使用5-10个5mm无菌玻璃珠粒将细菌菌苔分散在琼脂上。取出珠粒，并使平板干燥。将来自冷冻样本或20-24小时培养物的1-2个5μl蓝黑紫色杆菌JL007斑点加入到每个平板中，并使其干燥。模拟对照板不进行触碰。对照JL007培养物如上文针对拉姆齐测定所述生长。将所有平板在室温下培养4-6天。

结果是定性的。成功的结局显示，与模拟对照上的菌苔相比，在铺板的实验或JL007对照上有金黄色酿脓葡萄球菌菌落的稀疏集合。给出了1-3的定性得分，其中与模拟对照相比，1表明50-75％生长，2表明15-50％生长，并且3表明<15％生长。

结果、解释和结论

纯度测定

下表5中显示了每个平板的菌落数的估计值。代表性图像如图6所示。对于F107或F108摇瓶或收获的培养物，没有观察到非蓝黑紫色杆菌菌落，证实对于摇瓶和收获的培养物，该培养物是>99.99％的单一培养物。

表5

活力

在稀释至10^8CFU/ml、10^7CFU/ml和10^6CFU/ml之前和之后，测定来自F107和F108收获培养物的CFU/ml。图7示出了来自这些铺板的样本的CFU/ml，以及与收获时计数的比较。计数显示，在冰上转移收获的样本后活力没有明显损失，并且将样本以准确的方式稀释至10^8CFU/ml、10^7CFU/ml和10^6CFU/ml。

拉姆齐测定

主要使用未稀释的收获培养物和稀释至10^8、10^7和10^6的收获培养物来进行蓝黑紫色杆菌抗生测定，图8示出了模拟对照、10^8CFU/ml培养物和模拟对照的代表性图像。图10示出了模拟对照和实验样本的近端边缘大小(如图8c所示)之间的以mm为单位的差值。每个差值都是来自每个平板的四个红色毛癣菌菌落的平均值。可以得出结论，样本的稀释液显示为对红色毛癣菌的生长抑制没有显著影响；在最接近JL007十字的位置处观察到了红色毛癣菌菌落生长的约5mm减小。

金黄色酿脓葡萄球菌抗生测定.

来自金黄色酿脓葡萄球菌抗生测定的结果是定性的，因为用于该测定的方法导致来自收获的发酵罐的JL007均停止生长，但是有零星生长。为了比较目的，示出了来自先前发酵开发的代表性模拟和实验室生长的JL007的图像。表6显示了F107和F108的未稀释物和每种稀释液的定性得分。可以得出结论，F107和F108的未稀释物与稀释物之间没有差异。

表6.定性金黄色酿脓葡萄球菌抗生测定得分

总的来说，当直接从发酵罐分析时，来自F107和F108的未稀释培养物刚刚超过10^9CFU/ml。在稀释和铺板时，F107和F108两者都遵循都约10倍稀释的计数。振荡和收获样本的纯度>99.99％，表明是真正的单一培养物，这一点在两个发酵罐中均通过QPCR得到了证实。针对红色毛癣菌和金黄色酿脓葡萄球菌的活性测定显示未稀释的培养物与稀释的培养物之间没有差异，或者与摇瓶生长的对照相比没有差异，证实了发酵罐生长的培养物在抑制这些病原体的生长方面也有活性。

7.5.实施例5：毒力因子

总结

为了评估蓝黑紫色杆菌菌株的生物安全性，测试蓝黑紫色杆菌菌株的毒力因子，并通过执行计计算机模拟分析和湿实验室实验确认来检查其抗生素抗性特征。计算机模拟基因组挖掘显示，在五(5)个蓝黑紫色杆菌菌株的基因组中没有已知的毒力因子和抗生素抗性基因(表1)。抗生素测试表明，所测试的蓝黑紫色杆菌菌株对超过24种抗生素均有不同程度的敏感性。蓝黑紫色杆菌菌株对头孢菌素类、喹诺酮类和四环素类抗生素敏感，对氨基糖苷类、大环内酯类、氨曲南类、碳青霉烯类、美罗培南、氯霉素、克林霉素和阿莫西林/克拉维酸盐(4:1)不太敏感，并且是耐杆菌肽的。

材料和方法

全基因组鸟枪法测序和生物信息学分析

使用Nextera Flex试剂盒(Illumina)生成每种蓝黑紫色杆菌菌株的鸟枪法测序文库。将鸟枪法文库在HiSeq X上进行汇集和测序。测序读段被自动多路解编成单独的FASTA文件，通过生物信息血分析管线运行，从而产生由经清洁的测序读段装配的基因组。

通过CosmoID在线服务(cosmosid.com)运行每种蓝黑紫色杆菌菌株的基因组序列，以搜索毒力因子基因和已知的抗生素抗性基因。

内部抗生素抗性测试

将一个在50％BHI琼脂中生长了3天的蓝黑紫色杆菌菌落在1ml的1x PBS缓冲液中充分混合，分别稀释10倍和100倍。以三个重复将200μl稀释的蓝黑紫色杆菌细胞均匀地铺板到150mm有盖培养皿中的R2A/BHI琼脂平板上。使用圆盘分配器(BD BBL Sensi圆盘设计者分配器系统，12个位置)分配抗生素圆盘(BD BBL Sensi圆盘抗微生物敏感性测试圆盘)。将平板在室温下孵育2-3天，并在孵育结束时成像。

蓝黑紫色杆菌对抗生素的敏感性通过抗生素圆盘周围的蓝黑紫色杆菌细胞的清晰抑制区来反映。使用ImageJ测量抑制区，并将其转化为cm单位以用于分析。

抗生素MIC测试

使用从纯培养物生长和在胰蛋白胨水LB培养液中生长的蓝黑紫色杆菌执行抗生素抗性谱和MIC测试。

结果、解释和结论

对所有五种蓝黑紫色杆菌菌株进行测序，其中覆盖范围是基因组大小的至少100倍。将基因组序列装配成重叠群，并通过CosmosID(cosmosid.com)运行以搜索毒力因子基因和抗生素抗性基因。CosmosID拥有完善建立的关于细菌毒力因子基因和抗生素抗性基因的参考数据库。计算机模拟搜索没有发现任何已知的编码毒力因子和抗生素抗性的基因。

还使用来自在胰蛋白胨水LB培养液中生长的蓝黑紫色杆菌培养物的生长的蓝黑紫色杆菌，通过实验室测定证实了抗生素敏感性。所执行的抗生素测定显示，所有5种蓝黑紫色杆菌菌株均对以下抗生素/剂量敏感：10IU的盘尼西林、10μg的氨苄西林、10μg的链霉素、30μg的万古霉素、15μg的红霉素、30μg的强力霉素、30μg的四环素、30μg的头孢金素、5μg的环丙沙星和5μg的氯霉素(图5)。

蓝黑紫色杆菌菌株对头孢菌素类、喹诺酮类和四环素类抗生素敏感，对氨基糖苷类、大环内酯类、氨曲南类、碳青霉烯类、美罗培南、氯霉素、克林霉素和阿莫西林/克拉维酸盐(4:1)不太敏感，并且是耐杆菌肽的(表7和表8)。

表7.蓝黑紫色杆菌菌株的MIC表征

表8.蓝黑紫色杆菌菌株的MIC表征

7.6.实施例6：体外功效

总结

五(5)种独特的蓝黑紫色杆菌菌株已在实验室体外测定中被证明在环境温度和27℃下显著抑制皮肤真菌红色毛癣菌的生长。在30℃观察到了JL007对红色毛癣菌的轻度生长抑制。

材料和方法

微生物菌株

红色毛癣菌菌株18754购自ATCC，并根据使用说明书进行维护。将蓝黑紫色杆菌菌株用DMSO或甘油作为冷冻保护剂在-80℃存储。

拉姆齐体外抗生测定

体外测定是按照由Ramsey等人(2015)报道的工序建立的。简而言之，将约2×10^9CFU/ml的在50％vegLB(LB50)中生长了24小时的蓝黑紫色杆菌培养物使用无菌Q尖端在50％胰蛋白胨琼脂平板上以两条彼此垂直的直线划线。从在Sabouraud葡萄糖琼脂上生长了约1周的培养物中收获红色毛癣菌的分生孢子，使用血细胞计数器在标准显微镜下计数，并以每个斑点5μl的四个重复斑点以10^6个孢子/ml的浓度施加。将测定板在环境温度或27℃孵育如所指示的2-3周。在第7天、第14天和第21天拍摄图像。

抑制区的定量

红色毛癣菌的抑制被称为以cm为单位的菌落直径减少。首先使用ImageJ以像素(直线)为单位测量红色毛癣菌菌落的直径，并基于有盖培养皿的像素测量值将其转换为cm单位。

结果、解释和结论

使用DB02473从人分离的蓝黑紫色杆菌菌株进行蓝黑紫色杆菌-红色毛癣菌抗生测定。对于在环境温度下孵育的平板，红色毛癣菌从第4天开始生长超出初始接种点。在第7天，与蓝黑紫色杆菌共培养生长的经蓝黑紫色杆菌处理的红色毛癣菌菌落明显小于模拟对照(没有蓝黑紫色杆菌)菌落。在第14天，经蓝黑紫色杆菌处理的菌落明显小于对照菌落(图10)，表明蓝黑紫色杆菌对生长的强抑制。使用其他独特的蓝黑紫色杆菌菌株时观察到了类似的结果。

7.7.实施例7.代谢物

总结

蓝黑紫色杆菌的两种已知代谢物，紫色杆菌素和吲哚-3-甲醛，是参与蓝黑紫色杆菌施加的生长抑制的活性化合物。通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析在存在和不存在红色毛癣菌或金黄色酿脓葡萄球菌培养物的情况下，蓝黑紫色杆菌的代谢谱。阐明了由蓝黑紫色杆菌分离物产生的代谢物和在红色毛癣菌或金黄色酿脓葡萄球菌培养物存在下由蓝黑紫色杆菌上调的那些代谢物的完整光谱(表9)。吲哚-3-甲醛和17种其他代谢物相对于其他蓝黑紫色杆菌分离物在DB02473中独特地过表达(表10)。比较响应于病原攻击(金黄色酿脓葡萄球菌或红色毛癣菌)的每种蓝黑紫色杆菌分离物的显著表达的(与对照相比差异2倍)的代谢物(表11)。

材料和方法

将1.2ml样本用设定为40％强度的探头超声波仪进行超声处理达3×40s，其中在各次超声波脉冲之间在冰上放20s。该工序基于来自中试实验的发现，并且给出了蓝黑紫色杆菌DB02473的60-80％裂解。将经超声处理的材料以14,000x g离心2分钟。将700μl上清液转移到由Metabolon提供的带条形码的微量管中。将试管加盖，在液氮中快速冷冻并在-80℃存储。在快速冷冻后，将剩余的裂解物上清液在-80℃在冷冻箱中存储。

将快速冷冻的培养物在4℃解冻，并以14,000x g离心10分钟。将沉淀重悬于1ml甲醇中，并定量转移到珠粒击打试管中。将原始试管用1ml甲醇进一步洗涤，并在珠粒击打试管中与先前的1ml甲醇混合。将0.1mm玻璃珠粒加入到每个珠粒击打试管中，使得试管的圆锥形底部被填充。将试管置于Qiagene TissueLyser II中，并在30Hz进行10分钟的珠粒击打。将样本以14,000x g离心10分钟，并将上清液转移到干净的试管中。使用快速真空使甲醇在30℃蒸发。将沉淀重悬于200μl HPLC级甲醇中，并转移到自动进样器小瓶的插件中。

结果、解释和结论

用于鉴定与DB02473相比显著增加或减少了2倍的代谢物的方法。

1.根据DB02473，将与培养基对照或病原体比较的代谢物丰度从高到低排名。

2.计算DB02473:其他紫色杆菌属的比率。如果在至少4个其他菌株中有2倍的增加或减少，则代谢物被认为表现不同于DB02473菌株。

3.与培养基对照或病原体相比丰度不显著的代谢物被去除。

表9.所有蓝黑紫色杆菌菌株的代谢谱

表10.DB02473所独有的相对于其他菌株的代谢化合物2倍表达

表11.响应于病原攻击(金黄色酿脓葡萄球菌或红色毛癣菌)每个菌株的显著表达(与对照相比差异2倍)的代谢物

7.8实施例8.临床试验

人源蓝黑紫色杆菌DB02473可用于治疗和预防皮肤病。在IIa期、单剂量、剂量递增的临床试验中，DB02473 t表现出治疗足癣的功效(参考文献编号[https://www.dermbiont.com/in-the-news/dermbiont-an nounces-positive-data-from-phase-2a-clinical-trial-and-start-of-phase-2b-clinical-trial-for-athletes-foot-with-a-topical-live-biotherapeutic)。这些临床试验证明了以下观察结果：人源蓝黑紫色杆菌当生长在红色毛癣菌和金黄色酿脓葡萄球菌附近时，抑制红色毛癣菌和金黄色酿脓葡萄球菌的生长。

8.以引用方式并入

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件的全部内容均据此出于所有目的以引用方式并入，至如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独指示为出于所有目的以引用方式并入。

9.等同物

虽然已经图示和描述了各种具体实施方案，但是上述说明书不是限制性的。应当理解的是，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。在回顾本说明书时，许多变化对于本领域技术人员来说将变得显而易见。