一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法

摘要

一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法。现有的乳品行业中大肠杆菌和真菌检测技术以平板计数法为主，步骤繁琐，耗时耗资的问题。一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法，根据预实验方法分析牛乳中微生物紫外光谱吸收特性，获取酵母菌和大肠杆菌混合菌的紫外光谱数据信息；使用snv联合msc方法校正基线漂移和散射问题，并使用二维相关同步谱和异步谱与3D光谱结合的方法解决大肠杆菌特征点红移问题，进而得到大肠杆菌的紫外光谱吸收特征点及特征波段，建立神经网络吸光度与数量的预测模型，以检测酵母菌的数量。本发明具有检测速度快成本低的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法。

背景技术

牛乳因为受到奶牛体内以及挤奶、贮存、运输等过程中环境微生物的污染，生牛奶中会存在微生物包括细菌、真菌和酵母菌，其中以细菌的数量最多，严重影响牛乳的食用安全和产品质量。目前的乳品行业中大肠杆菌和真菌检测技术以平板计数法为主，耗时在4-48小时之间，步骤繁琐，而测试片价格较贵，每片价格约为15元。牛乳的生产加工工艺、环境复杂，容易被多种细菌感染，目前的检测技术很难做到每步必检、应检、尽检。

由于紫外光谱法检测微生物技术具有快速、方便、成本低的特点，因此，建立一种紫外光谱法检测牛乳中微生物的方法对提升乳制品企业检测能力，保障乳品安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的乳品行业中大肠杆菌和真菌检测技术以平板计数法为主，步骤繁琐，耗时耗资的问题，而提出一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法。

一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法，所述的方法通过以下步骤实现：

步骤一、通过预实验方法分析牛乳中微生物紫外光谱吸收特性；

步骤二、根据预实验方法得出的结果，设计正式实验方法，获取酵母菌和大肠杆菌混合菌的紫外光谱数据信息：

步骤三、使用snv联合msc方法校正因牛乳中生物大分子和两种菌引起的基线漂移和散射问题，并使用二维相关同步谱和异步谱与3D光谱结合的方法解决大肠杆菌特征点红移问题，进而得到大肠杆菌的紫外光谱吸收特征点及特征波段；

所述的snv的中文含义为标准正态变量变换；

所述的msc的中文含义为多粒径散射校正法；

步骤四、使用提取出的特征波段，建立神经网络吸光度与数量的预测模型，以检测酵母菌的数量。

优选地，步骤二所述的正式实验方法的具体内容为：将培养好的大肠杆菌和酵母菌经过分离、纯化以后，分别用麦氏比浊法将菌悬液配置在设定的浓度范围中，将配置好的酵母菌以固定浓度添加到巴氏灭菌牛乳中作为干扰检测菌种，再以大肠杆菌浓度梯度变化为外扰因素滴入混合菌牛乳中，使用紫外可见光光度计依次测定各种样品的光谱曲线并做好记录，获取紫外光谱数据信息。

优选地，所述的麦氏比浊法将大肠杆菌和酵母菌两种菌浓度范围为接近1.5*10

优选地，步骤三所述的得到大肠杆菌的紫外光谱吸收特征点及特征波段的方法为，

受到红移影响大肠杆菌特征吸收峰整体发生偏移，在260nm至280nm未见明显吸收特性；为寻找牛乳中大肠杆菌特征峰偏移后具体位置同时解析各特征吸收点对应物质的具体信息，本文在建立模型之前利用二维相关分析法对特征吸收波段300nm-500nm进行识取；二维动态光谱在一维光谱的基础上增加了一种扰动，根据扰动后光谱的变化形式来判断各吸收峰所对应的物质，本文利用大肠杆菌的生物浓度为外部扰动，分析在不同大肠杆菌生物浓度二维动态光谱的变化形式，其具体算法如下所示：

须将时域中所测得的动态光谱转换到频域以进一步获得二维动态光谱中所含信号的频域信息；用傅里叶变换将光谱信号由时域转化到频域，其中动态光谱

光谱

将数学中的交叉分析用于两个来自不同光谱中的变量v

当动态光谱的数据量较大，数目较多时，常以Hilbert变换方法用于代替傅氏变换以达到简化计算的目的，同时Hilbert变换克给出明确的物理意义；

异步相关光谱的计算如下其中

求得二维同步相关光谱图、二维异步相关光谱图、波数同步3D光谱图的整体二维动态光谱；

根据Noda原则，将三类二维相关图谱结合起来，拾取出361nm,362nm,364nm,365nm,373nm,378nm,330nm,381nm,383nm,393nm,403nm,404nm,406nm,411nm,426nm,458nm,463nm,466nm,469nm,473nm,475nm等21个特征点随着大肠杆菌生物浓度的增高同步增强，这些位置发现较强自相关峰，可知360nm-430nm和455nm-480nm为红移后的大肠杆菌的特征吸收波段。

优选地，

步骤四所述的使用提取出的特征波段，建立神经网络吸光度与数量的预测模型，以检测酵母菌的数量的过程，具体为：

通过BP神经网络分析整条光谱曲线数据上的特征；

利用遗传算法训练优化BP算法，在训练神经网络时，不断的优化每一层的权值和偏置值，使最终网络输出与期望输出之间的误差最小，缩小到期望的值，

基于紫外可见光谱和遗传算法联合BP神经网络的牛乳中存在固定浓度酵母菌背景下大肠杆菌微生物定量检测的方法；结合snv与s-g卷积平滑法处理所得光谱提高特征强度、降低噪声；将二维相关分析识取出的大肠杆菌特征波段作为初始数据与遗传算法联合BP神经网络结合建立预测模型；

大肠杆菌遗传物质及膜蛋白上含有共轭π键，根据共轭π键在紫外光谱区反映的吸收峰位置以及对应吸光度值对待测微生物总数进行定量分析。

本发明的有益效果为：

本发明方法预测得到的结果不仅适于牛乳中微生物含量的测算，其检测速度快，准确性高。本发明方法也适用于其他食品药品中微生物含量的定量检测。同时该方法的提出对其他复杂背景下其它菌种存在的情况下微生物浓度的定量无损测算有着重要的引导意义和启发作用，对食品药品安全和质量监督意义重大。

附图说明

图1为本发明的流程图；

图2为本发明涉及的未校正的光谱曲线原图；

图3为本发明涉及的多元散射校正联合标准正态变量变换后的光谱曲线。

具体实施方式

具体实施方式一：

本实施方式的一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法，所述方法通过以下步骤实现：

步骤一、通过预实验方法分析牛乳中微生物紫外光谱吸收特性；

步骤二、根据预实验方法得出的结果，设计正式实验方法，获取酵母菌和大肠杆菌混合菌的紫外光谱数据信息：

步骤三、使用snv联合msc方法校正因牛乳中生物大分子和两种菌引起的基线漂移和散射问题，并使用二维相关同步谱和异步谱与3D光谱结合的方法解决大肠杆菌特征点红移问题，进而得到大肠杆菌的紫外光谱吸收特征点及特征波段；

所述的snv的中文含义为标准正态变量变换，标准正态变量变换是一种作用于全波段的光谱处理算法，对每一测定样品全波段的光谱吸光度减去光谱吸光度的均值，最后除以光谱吸光度的标准差，从而获得SNV校正光谱的最终结果，所以标准正态变换对不同组样品光谱在采集过程中产生的基线漂移问题同样具有矫正作用；

所述的msc的中文含义为多粒径散射校正法；通过msc法，对光谱曲线由不同大小脂肪球、不同络合状态酪蛋白胶束、不同生长周期大肠杆菌和酵母菌联合导致的散射问题进行校正；

对比分析图2原图及图3多元散射校正联合标准正态变量变换后的光谱曲线可知，标准正态变量变换不仅消除了因牛乳中生物大分子粒径不一、浓度不均而引入的散射问题，同时增强了各光谱曲线的特征强度；

步骤四、使用提取出的特征波段，建立神经网络吸光度与数量的预测模型，以检测酵母菌的数量。

具体实施方式二：

与具体实施方式一不同的是，本实施方式的一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法，步骤二所述的正式实验方法的具体内容为：将培养好的大肠杆菌和酵母菌经过分离、纯化以后，分别用麦氏比浊法将菌悬液配置在设定的浓度范围中，将配置好的酵母菌以固定浓度添加到巴氏灭菌牛乳中作为干扰检测菌种，再以大肠杆菌浓度梯度变化为外扰因素滴入混合菌牛乳中，使用紫外可见光光度计依次测定各种样品的光谱曲线并做好记录，获取有效的紫外光谱数据信息。

具体实施方式三：

与具体实施方式二不同的是，本实施方式的一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法，所述的麦氏比浊法将大肠杆菌和酵母菌两种菌浓度范围为接近1.5*10

具体实施方式四：

与具体实施方式一、二或三不同的是，本实施方式的一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法，步骤三所述的得到大肠杆菌的紫外光谱吸收特征点及特征波段的方法为，

受到红移影响大肠杆菌特征吸收峰整体发生偏移，在260nm至280nm未见明显吸收特性。为寻找牛乳中大肠杆菌特征峰偏移后具体位置同时解析各特征吸收点对应物质的具体信息，本文在建立模型之前利用二维相关分析法对特征吸收波段300nm-500nm进行识取。二维动态光谱在一维光谱的基础上增加了一种扰动，根据扰动后光谱的变化形式来判断各吸收峰所对应的物质，本文利用大肠杆菌的生物浓度为外部扰动，分析在不同大肠杆菌生物浓度二维动态光谱的变化形式，其具体算法如下所示：

须将时域中所测得的动态光谱转换到频域以进一步获得二维动态光谱中所含信号的频域信息；用傅里叶变换将光谱信号由时域转化到频域，其中动态光谱

光谱

将数学中的交叉分析(Cross-correction Analysis)用于两个来自不同光谱中的变量v

当动态光谱的数据量较大，数目较多时，常以Hilbert变换方法用于代替傅氏变换以达到简化计算的目的，同时Hilbert变换克给出明确的物理意义；

异步相关光谱的计算如下其中

求得二维同步相关光谱图、二维异步相关光谱图、波数同步3D光谱图的整体二维动态光谱如下：

根据Noda原则，将三类二维相关图谱结合起来，拾取出

361nm,362nm,364nm,365nm,373nm,378nm,330nm,381nm,383nm,393nm,403nm,404nm,406nm,411nm,426nm,458nm,463nm,466nm,469nm,473nm,475nm等21个特征点随着大肠杆菌生物浓度的增高同步增强，这些位置发现较强自相关峰，可知360nm-430nm和455nm-480nm为红移后的大肠杆菌的特征吸收波段。

具体实施方式五：

与具体实施方式四不同的是，本实施方式的一种牛乳中酵母菌和大肠杆菌的紫外光谱特征分析及定量检测方法，步骤四所述的使用提取出的特征波段，建立神经网络吸光度与数量的预测模型，以检测酵母菌的数量的过程，具体为：

染菌牛乳的紫外可见光谱数据量庞大，有用信息点颇多，特征信息具有连续性，通过BP神经网络分析整条光谱曲线数据上的特征，有效地兼顾了样本的光谱信息和生化试验测量值，使所筛选出的数据信息更具有代表性和适用性；

利用遗传算法训练优化BP算法，BP算法在拟合非线性函数时，虽然可以收敛，但是有可能收敛到局部最小点，这是源于它的搜索是串行搜索，而遗传算法的并行性，能够使其更容易收敛到全局最小点。在训练神经网络时，不断的优化每一层的权值和偏置值，使最终网络输出与期望输出之间的误差最小，缩小到期望的值，而这个优化的过程，就是权值和偏置值不断“进化”的过程，在每一次优化迭代过程中，权值与偏置值由于“自然环境”发生选择，突变，交叉，然后留下优的品种(权值和偏置值使输出误差最小)，淘汰劣的品种，进而经过多次迭代，权值与偏置值的“基因”会越来越好，从而达到训练目的。

考虑到微生物形态学结构和化学成分对光的吸收波段不同，研究了基于紫外可见光谱和遗传算法联合BP神经网络的牛乳中存在固定浓度酵母菌背景下大肠杆菌微生物定量检测的方法；结合snv与s-g卷积平滑法处理所得光谱提高特征强度、降低噪声；将二维相关分析识取出的大肠杆菌特征波段作为初始数据与遗传算法联合BP神经网络结合建立预测模型，所得的预测结果与平板计数结果进行对比，计算出相对误差。本发明研究结果不仅适于牛乳中微生物含量的测算，因其检测速度快，准确性高的特点也适用于其他食品药品中微生物含量的定量检测。同时该方法的提出对其他复杂背景下其它菌种存在的情况下微生物浓度的定量无损测算有着重要的引导意义和启发作用，对食品药品安全和质量监督意义重大；

利用苯环共轭结构电子成键轨道不稳定在吸收能量时发生跃迁，使出射光小于入射光的原理，大肠杆菌遗传物质及膜蛋白上含有共轭π键，根据共轭π键在紫外光谱区反映的吸收峰位置以及对应吸光度值对待测微生物总数进行定量分析。