一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法，具体操作方法为：选取发酵过程中的发酵物100g，用10ml的95%乙醇和190ml的水加盖浸提2h，将浸提液稀释40倍后，在330nm波长下；以无菌水为参比测定吸光度，测得的吸光度代入标准曲线1的回归方程中，得出的浓度先乘以稀释倍数40，再乘以纯度系数81.36%，即可得到该阶段发酵物中阿魏酸的含量。本发明的优点：该方法简单可行，利用无菌水+95%乙醇的配比提取阿魏酸损失较小，并且提取时间短，得出来的数据回归性好，可信度高。

说明书

技术领域

本发明涉及阿魏酸含量检测技术领域，具体是指一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法。

背景技术

“高氏15号”是湖北省农科院植保土肥研究所发现的一种新型生防菌，以其为原料制作的生物菌肥的发酵工艺已经实现了一定的工厂生产化，在生产过程中，对关键指标的跟踪检测是用来判断发酵程度的重要手段。除了pH、温度等物理指标外，发酵产物中阿魏酸的含量可以作为判断发酵程度的重要依据，因为在高氏15号等微生物菌株的发酵物料中有大量的秸秆、米糠等作物的根茎叶部分，这些部分含有较为丰富的阿魏酸，在腐熟发酵过程中会释放出大量游离态的阿魏酸。

现有的微生物菌株发酵产物中测定阿魏酸含量的方法有高效液相色谱法，薄层扫描法、毛细管电泳法等，但这些方法所需要的仪器设备昂贵，操作也较为繁琐。

发明内容

本发明为了解决上述的各种问题，提供了一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一：准备试验材料

不同发酵时期的微生物菌株发酵产物，反式阿魏酸标准品，95％乙醇，冰醋酸，甲醇，氯仿，紫外分光光度计，万分之一电子天平；

步骤二：试验方法

预试验，具体包括以下步骤：

A.阿魏酸标准液的配制

(1)精确称取阿魏酸标准品20mg于2ml离心管中，先用50μl的95％乙醇溶解，再加入1.95ml的无菌水，取10μl该溶液，用无菌水稀释至1ml，即可得到浓度为0.1mg/ml的阿魏酸标准液①；

(2)精确称取阿魏酸标准品20mg于2ml离心管中，用2ml的95％乙醇溶解，取10μl该溶液，用无菌水稀释至1ml，即可得到浓度为0.1mg/ml的阿魏酸标准液②；

B.阿魏酸标准曲线的绘制

(1)用无菌水将0.1mg/ml的阿魏酸标准液①配制成0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml这7个浓度梯度；以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到标准曲线1；

(2)用95％乙醇将0.1mg/ml的阿魏酸标准液②配制成0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml这7个浓度梯度；以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到标准曲线2；

步骤三：样品处理

A.微生物菌株浸提液的制备

称取微生物菌株发酵产物100g，按质量体积比1：2：0.2加入无菌水和95％乙醇，加盖静置2h，双层纱布过滤，制得浸提液；

B.层析液的选择及配制

在多种层析液配比中，选择体积比为氯仿：甲醇：水：冰醋酸为2：2：6：0.5的层析液进行层析，阿魏酸可以与其他物质完全分离，斑点集中，无拖尾现象；用移液枪吸取上述溶液，将溶液依次加入到试剂瓶中，振荡摇匀，期间敞开瓶盖放气，然后静置，直至完全分层；

C.浸提液中阿魏酸含量的测定

(1)用无菌水分别将浸提液稀释5、10、20、40、100、200、400、1000倍，以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以稀释倍数的倒数为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到吸收曲线1；

(2)用微量进样器分别吸取各稀释倍数的浸提液10μl，长条状均匀点样于层析滤纸上，冷风吹干，以步骤三中B步骤中的层析液展开；在紫外灯定位后剪下含有标准液的层析滤纸，装入20ml的具塞试管中，加入10ml95％乙醇，振荡15min，吸取上清液；以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以稀释倍数的倒数为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到吸收曲线2。

优选的，所述紫外分光光度计的型号为UV-1780。

优选的，具体操作方法为：选取发酵过程中的发酵物100g，用10ml的95％乙醇和190ml的水加盖浸提2h，将浸提液稀释40倍后，在330nm波长下；以无菌水为参比测定吸光度，测得的吸光度代入标准曲线1的回归方程中，得出的浓度先乘以稀释倍数40，再乘以纯度系数81.36％，即可得到该阶段发酵物中阿魏酸的含量。

本发明与现有技术相比的优点在于：本发明不需要用到多种昂贵仪器，在确定纯度系数后便可直接用分光光度法对阿魏酸含量进行检测，目前，微生物菌肥发酵工艺正在逐渐成熟，发酵模式的物料配比及发酵过程也逐渐标准化、清晰化。在发酵过程中我们将阿魏酸作为一项检测指标，不需要对进行分离、提纯等操作，只需要知道其大致浓度，用于了解发酵进行情况，因此，在微生物菌株的发酵模式下该检测方法快捷简便的优点得以体现。

附图说明

图1是本发明一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法的标准曲线1示意图。

图2是本发明一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法的标准曲线2示意图。

图3是本发明一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法的吸收曲线1示意图。

图4是本发明一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法的吸收曲线2示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。

一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一：准备试验材料

不同发酵时期的微生物菌株发酵产物；反式阿魏酸标准品(上海源叶生物科技有限公司)，95％乙醇(武汉兴和达商贸有限公司)，冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(国药集团化学试剂有限公司)，氯仿(国药集团化学试剂有限公司)

仪器与设备

紫外分光光度计/UV-1780(岛津企业管理(中国)有限公司)，万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)

步骤二试验方法

预试验

A.阿魏酸标准液的配制

(1)精确称取阿魏酸标准品20mg于2ml离心管中，先用50μl的95％乙醇溶解，再加入1.95ml的无菌水，取10μl该溶液，用无菌水稀释至1ml，即可得到浓度为0.1mg/ml的阿魏酸标准液①。

(2)精确称取阿魏酸标准品20mg于2ml离心管中，用2ml的95％乙醇溶解，取10μl该溶液，用无菌水稀释至1ml，即可得到浓度为0.1mg/ml的阿魏酸标准液②。

B.阿魏酸标准曲线的绘制

(1)用无菌水将0.1mg/ml的阿魏酸标准液①配制成0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml这7个浓度梯度。以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到标准曲线1；

(2)用95％乙醇将0.1mg/ml的阿魏酸标准液②配制成0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml这7个浓度梯度。以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到标准曲线2。

步骤三：样品处理

A.微生物菌株浸提液的制备

称取微生物菌株发酵产物100g，按质量体积比1：2：0.2加入无菌水和95％乙醇，加盖静置2h，双层纱布过滤，制得浸提液。

B.层析液的选择及配制

在多种层析液配比中，选择体积比为氯仿：甲醇：水：冰醋酸＝＝2：2：6：0.5的层析液进行层析，阿魏酸可以与其他物质完全分离，斑点集中，无拖尾现象。

用移液枪吸取上述溶液，将溶液依次加入到试剂瓶中，振荡摇匀，期间敞开瓶盖放气，然后静置，直至完全分层。

C.浸提液中阿魏酸含量的测定

(1)用无菌水分别将浸提液稀释5、10、20、40、100、200、400、1000倍，以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以稀释倍数的倒数为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到吸收曲线1；

(2)用微量进样器分别吸取各稀释倍数的浸提液10μl，长条状均匀点样于层析滤纸上，冷风吹干，以2.2.1中的层析液展开。在紫外灯定位后剪下含有标准液的层析滤纸，装入20ml的具塞试管中，加入10ml95％乙醇，振荡15min，吸取上清液。以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以稀释倍数的倒数为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到吸收曲线2。

结果与分析

标准曲线与回归方程

结合附图1，在无菌水中阿魏酸标准品的浓度与吸光呈现良好的线性关系，且吸光度的值较高，有利于记录观测；

其回归方程为：Y(浓度μg/ml)＝(a(吸光度)-0.0031)/0.0045

结合附图2，在95％乙醇中阿魏酸标准品的浓度与吸光虽然呈现良好的线性关系，但是吸光度的值较低，不利于记录观测及计算；

其回归方程为：Y(浓度μg/ml)＝(a(吸光度)+0.0003)/0.00004

对比附图1和附图2发现，选用无菌水+95％乙醇(体积比20：1)溶解所得的溶液，在无菌水做参比的条件下得到的吸光度值更高，更便于记录及计算。

吸收曲线与稀释倍数

结合附图3，当稀释倍数在10～40倍时，浸提液粗提粗阿魏酸的吸光度的范围在标准曲线1的置信区间内；

结合附图4，当稀释倍数在10～40倍时，浸提液中细提阿魏酸的吸光度的范围在标准曲线1的置信区间内；

对比附图3与附图4发现，稀释倍数在10～40倍时所测出的吸光度大小适宜，有利于检测。

吸收曲线与纯度系数

表1浸提液(细)与浸提液(粗)吸光度的比值

表1表明，发现浸提液细提取阿魏酸与粗提阿魏酸的比值在80％～83％间，大部分在81％左右，经计算后，将其平均数81.36％作为浸提液中阿魏酸含量测定的纯度系数。

检测方法总结

选取发酵过程中的发酵物100g，用10ml的95％乙醇和190ml的水加盖浸提2h，将浸提液稀释40倍后(稀释倍数在10～40倍内均可)，在330nm波长下。以无菌水为参比测定吸光度，测得的吸光度代入标准曲线1的回归方程中，得出的浓度先乘以稀释倍数40，再乘以纯度系数81.36％，即可得到该阶段发酵物中阿魏酸的含量。

该方法简单可行，利用无菌水+95％乙醇的配比提取阿魏酸损失较小，并且提取时间短，得出来的数据回归性好，可信度高。

适用情况

该方法不需要用到多种昂贵仪器，在确定纯度系数后便可直接用分光光度法对阿魏酸含量进行检测，目前，微生物菌肥发酵工艺正在逐渐成熟，发酵模式的物料配比及发酵过程也逐渐标准化、清晰化。在发酵过程中我们将阿魏酸作为一项检测指标，不需要对进行分离、提纯等操作，只需要知道其大致浓度，用于了解发酵进行情况，因此，在微生物菌株的发酵模式下该检测方法快捷简便的优点得以体现。

试验误差

阿魏酸在浸提过程中仍存在一定损失，试验过程中也存在一定的误差。但实验结果表明，0.5h内，以水作为溶剂所测得的吸光度变化不大，因此，只要浸提之后的测定工作尽快完成，这种方法的误差会大大减小，可以得到推广。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。