一种基于高分辨质谱技术鉴别食品中中药材成分的方法

摘要

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种基于高分辨质谱技术鉴别食品中中药材成分的方法，包括以下步骤：从不同中药材中筛选各自的特征组分，获得不同中药材对应的特征组分清单；将不同中药材分别采用醇溶剂提取，得到各自的提取液；采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱检测所得提取液，建立不同中药材对应的特征组分的质谱数据库；将待测食品采用醇溶剂提取，采用相同的液质条件检测所得提取液，并在所得质谱数据库中进行匹配，根据匹配结果鉴别待测食品中的中药材成分。本发明提供的鉴别方法，可以实现无标准品情况下中药材的定性筛查，具有高通量、准确、简便、快捷的特点，解决了食品中非法添加中药材难以识别和确证的难题。

说明书

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种基于高分辨质谱技术鉴别食品中中药材成分的方法。

背景技术

在食品中违法添加中药材对人体健康具有潜在或显性的危害，就中药材的性质而言，中药材都有功能主治、适用人群、用法用量，具有与食品完全不同的功效和服用禁忌。但是，一些食品生产企业受利益的驱动，只顾中药材功效而忽视其毒性和副作用，在所谓的“食疗”、“养生”等食品中违法添加中药材，例如：含有“生地”的炖鸭煲调料包、含有“党参”、“木香”、“白术”的茶叶、含有“女贞子”和“淫羊藿”的椰园海宝(干制水产品)、含有“红豆杉”和“金樱子”的配制酒、含有“杜仲”和“淫羊藿”的饮料等。

在打击向普通食品和保健食品中违法添加中药材的行为过程中，监管部门执法人员只能通过查看产品配料表和到企业现场巡查等最传统的方式来判断食品中是否违法添加中药材，但往往会因生产企业不如实标注配料表或生产现场对非法添加的中药材原料进行隐藏等情况，形成监管盲区。因此，食品中非法添加中药材的鉴别工作在技术手段上面临巨大的挑战。

目前中药材非法添加鉴别手段，主要有薄层鉴别、中药材特征图谱或指纹图谱鉴定、DNA条形码分子鉴定等方法，但是这些手段都是对中药材原料的真伪鉴别，对食品中违法添加中药材的识别和鉴别，从本质上可追溯为鉴定其违法添加中药材的化学成分，而由于食品原料的多样性、食品基质和加工工艺的复杂性、加入的中药材品种未知性等原因，导致所添加的中药材在食品中可能与中药材原料中的特征图谱或指纹图谱发生了变化，因而以上几种鉴别方法不适用于食品中违法添加中药材的鉴别。

随着质谱技术的发展，超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF)具有分析速度快、灵敏度和分辨率高、多组分同时测定的优点，在分离分析复杂食品基质中的内源性组分和外来添加物中具有显著优势，大大提升了色谱质谱联用技术的适用性，甚至无需对照品，即可通过高精度的谱图信息解析产品的特征组分。虽然，现在也存在中药材中部分组分的质谱库，但其所含化合物数量少，且化合物未与中药材进行关联，难以实现对食品中中药材的快速鉴别。

本发明根据上述情况，建立“中药材-特征组分”对应清单，构建了食品中易非法添加的70种中药材中434种特征组分高分辨质谱库，开发出一种基于超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱信息的食品中中药材鉴别方法，解决了食品中非法添加中药材难以识别和确证的难题，为打击食品中非法添加中药材违法行为提供技术方法和依据。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种基于高分辨质谱技术鉴别食品中中药材成分的方法，通过建立“中药材-特征组分”对应清单，构建了食品中易非法添加的70种中药材中434种特征组分高分辨质谱库，开发出一种基于超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱信息的食品中中药材鉴别方法，解决了食品中非法添加中药材难以识别和确证的难题，为打击食品中非法添加中药材违法行为提供技术方法和依据。

具体来说，本发明提供了如下技术方案。

一种基于高分辨质谱技术鉴别食品中中药材成分的方法，包括以下步骤：

S1、从不同中药材中筛选各自的特征组分，获得不同中药材对应的特征组分清单；

S2、将不同中药材分别采用醇溶剂提取，得到各自的提取液；采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱分别检测所得提取液，建立不同中药材对应的特征组分的质谱数据库；

S3、将待测食品采用醇溶剂提取，得到提取液；采用与S2中相同的超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱条件检测所得提取液，并在S2所得质谱数据库中进行匹配，根据匹配结果鉴别待测食品中的中药材成分。

优选的，上述方法中，S1中，所述不同中药材为70种中药材，具体为：土茯苓、大蓟、女贞子、山茱萸、川牛膝、川芎、丹参、五味子、升麻、巴戟天、木香、牛蒡子、车前子、车前草、平贝母、玄参、生地黄、白及、白术、白芍、地骨皮、红花、红景天、吴茱萸、怀牛膝、杜仲、沙苑子、牡丹皮、芦荟、苍术、补骨脂、诃子、赤芍、远志、麦门冬、佩兰、制何首乌、刺五加、泽泻、知母、罗布麻、金荞麦、金樱子、厚朴、姜黄、枳壳、枳实、柏子仁、茜草、首乌藤、骨碎补、桑白皮、桑枝、益母草、积雪草、淫羊藿、菟丝子、银杏叶、黄芪、湖北贝母、番泻叶、蒲黄、蒺藜、蜂胶、墨旱莲、熟大黄、熟地黄、天门冬、刺玫果、侧柏叶。

优选的，上述方法中，S1中，所述不同中药材对应的特征组分清单如下：

优选的，上述方法中，S2中，所述醇溶剂为甲醇，优选的，进行提取时，以1g中药材计，所述甲醇的添加量为5～15mL。

优选的，上述方法中，S2中，所述建立不同中药材对应的特征组分的质谱数据库具体为：依据不同中药材对应的特征组分清单，将不同中药材对应的特征组分质谱图添加入质谱数据库中，同时输入中药材(序号)-特征组分名、英文名称、CAS号、分子量、分子式、保留时间等信息。

优选的，上述方法中，S2中，超高效液相色谱采用以下条件：

色谱条件：色谱柱：Thermo Accucore aQ色谱柱，150×2.1mm，2.6μm；

柱温：35℃；

进样量：5μL；

流速：0.3mL/min；

正离子扫描模式：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸水溶液；

负离子扫描模式：流动相A为乙腈，流动相B为超纯水；

采用二元梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，

在第0～2min，所述流动相A的体积为5％，所述流动相B的体积为95％；

在第2～20min，所述流动相A的体积由5％递增为95％，所述流动相B的体积由95％递减为5％；

在第20～25min，所述流动相A的体积为95％，所述流动相B的体积为5％；

在第25～26min，所述流动相A的体积由95％递减为5％，所述流动相B的体积由5％递增为95％；

在第26～30min，所述流动相A的体积为5％，所述流动相B的体积为95％。

优选的，上述方法中，S2中，四级杆飞行时间质谱采用以下条件：

离子源：电喷雾离子源；

正离子扫描模式：电喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；气帘气：35psi；雾化气：55psi；辅助气：55psi；去簇电压：60V；碰撞能量：35V；扫描方式采用全扫描一级质谱，质量采集范围100-1000Da；全扫描二级质谱，质量采集范围50-1000Da；

负离子扫描模式：电喷雾电压：4500V；离子源温度：550℃；气帘气：35psi；雾化气：55psi；辅助气：55psi；去簇电压：60V；碰撞能量：35V；扫描方式采用全扫描一级质谱，质量采集范围100-1000Da；全扫描二级质谱，质量采集范围50-1000Da。

优选的，上述方法中，正离子扫描模式、负离子扫描模式均以10mmol/L甲酸钠溶液作为质量数校正液。

优选的，上述方法中，S3中，所述醇溶剂为甲醇，优选的，进行提取时，以1g待测食品计，所述甲醇的添加量为5～15mL。

优选的，上述方法中，S3中，所述匹配为根据待测食品的提取液中物质的保留时间、一级精确质量数和二级质谱图与所述质谱数据库进行搜索匹配，判断待测食品中是否含有中药材中的特征组分。

本发明所取得的有益效果：

本发明提供的基于超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用技术鉴别食品中中药材成分的方法，可以实现无标准品情况下中药材的定性筛查，具有高通量、准确、简便、快捷等特点，解决了食品中非法添加中药材难以识别和确证的难题，为打击食品中非法添加中药材违法行为提供技术方法和依据。

附图说明

图1为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿1-淫羊藿苷的二级质谱图。

图2为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿2-朝藿定A的二级质谱图。

图3为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿3-朝藿定B的二级质谱图。

图4为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿4-朝藿定C的二级质谱图。

图5为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿5-宝藿苷Ⅰ的二级质谱图。

图6为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿6-宝藿苷II的二级质谱图。

图7为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿7-2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II的二级质谱图。

图8为配制酒样品与淫羊藿标准药材中淫羊藿1-淫羊藿苷碎片离子镜像图对比。

图9为配制酒样品与淫羊藿标准药材中淫羊藿2-朝藿定A碎片离子镜像图对比。

图10为配制酒样品与淫羊藿标准药材中淫羊藿3-朝藿定B碎片离子镜像图对比。

图11为配制酒样品与淫羊藿标准药材中淫羊藿4-朝藿定C碎片离子镜像图对比。

图12为配制酒样品与淫羊藿标准药材中淫羊藿5-宝藿苷Ⅰ碎片离子镜像图对比。

图13为配制酒样品与淫羊藿标准药材中淫羊藿6-宝藿苷II碎片离子镜像图对比。

图14为配制酒样品与淫羊藿标准药材中7-2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II碎片离子镜像图对比。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。

本发明构建的一种基于高分辨质谱技术鉴别食品中非法添加中药材的方法，包括：(1)从不同中药材中筛选各自的特征组分，形成“中药材—特征组分”对应清单，清单中每种中药材的特征组分为5-10种；(2)采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱构建中药材特征组分的质谱数据库；(3)样品前处理，称取1g食品待测样品，以10mL甲醇为提取溶剂，超声提取10min，静置30min后，取上清液过0.22μm有机滤膜，滤液在与步骤(2)相同的测试条件下测定；(4)将步骤(3)测定所得物质的保留时间、一级精确质量数和二级质谱图与质谱数据库进行搜索匹配，判断样品中是否含有中药材中的特征组分；(5)依据质谱库中该中药材的特征组分的检出情况判断中药材的种类。

所述步骤(1)的从不同中药材中筛选各自的特征组分的具体包括：

对市场上不同产地、不同时间采摘的多批次白术、金樱子、淫羊藿等70种中药材原料模拟配制酒与代用茶生产工艺，形成非法添加中药材模拟样品；对非法添加中药材模拟食品样品经醇溶剂提取后采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱进行数据采集，通过对中药材模拟食品样品与空白模拟样品进行色谱峰比对确定差异成分色谱峰，依据差异成分一级精确质量数与二级碎片离子解析化合物结构式等过程识别特征组分，并用大量样本与相应标准品来进行确证，形成“中药材—特征组分”对应清单，清单中每种中药材的特征组分为5-10种。

所述的中药材为70种中药材，具体为：土茯苓、大蓟、女贞子、山茱萸、川牛膝、川芎、丹参、五味子、升麻、巴戟天、木香、牛蒡子、车前子、车前草、平贝母、玄参、生地黄、白及、白术、白芍、地骨皮、红花、红景天、吴茱萸、怀牛膝、杜仲、沙苑子、牡丹皮、芦荟、苍术、补骨脂、诃子、赤芍、远志、麦门冬、佩兰、制何首乌、刺五加、泽泻、知母、罗布麻、金荞麦、金樱子、厚朴、姜黄、枳壳、枳实、柏子仁、茜草、首乌藤、骨碎补、桑白皮、桑枝、益母草、积雪草、淫羊藿、菟丝子、银杏叶、黄芪、湖北贝母、番泻叶、蒲黄、蒺藜、蜂胶、墨旱莲、熟大黄、熟地黄、天门冬、刺玫果、侧柏叶。

所述步骤(2)的超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱构建中药材特征组分数据库的具体包括：

1)收集中药材特征组分的相关信息，包括英文名称、CAS号、分子量、分子式等；

2)标准药材提取液的制备，分别称取70种标准药材1g，以10mL甲醇为提取溶剂，超声提取10min，静止30min后，取上清液过0.22μm有机滤膜，待测；

3)将标准药材提取液分别用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析。

4)依据“中药材—特征组分”对应清单，将标准药材的特征组分质谱图添加入质谱数据库中，同时输入中药材(序号)-特征组分名、英文名称、CAS号、分子量、分子式、保留时间等信息。图1为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿1-淫羊藿苷的二级质谱图；图2为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿2-朝藿定A的二级质谱图；图3为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿3-朝藿定B的二级质谱图；图4为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿4-朝藿定C的二级质谱图；图5为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿5-宝藿苷Ⅰ的二级质谱图；图6为淫羊藿标准药材对应的特征组分淫羊藿6-宝藿苷II的二级质谱图。

所述的超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析条件具体包含：

a.色谱条件：色谱柱：Thermo Accucore aQ色谱柱(150×2.1mm,2.6μm)；柱温：35℃；进样量：5μL；流速：0.3mL/min；正离子扫描模式流动相A为乙腈，流动相B为0.1％(v/v)甲酸水溶液；负离子扫描模式流动相A为乙腈，流动相B为超纯水；二元梯度洗脱，洗脱程序为：0-2min，5％A；2-20min，5％A-95％A；20-25min，95％A；25-26min，95％A-5％A；26-30min，5％A。

b.质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI源)；正离子扫描模式：电喷雾电压(IS)：5500V；离子源温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35psi；雾化气(GS1)：55psi；辅助气(GS2)：55psi；去簇电压(DP)：60V；碰撞能量(CE)：35V；扫描方式采用全扫描一级质谱(MS)，质量采集范围100-1 000Da；全扫描二级质谱(MS/MS)，质量采集范围50-1 000Da。负离子扫描模式：电喷雾电压(IS)：4500V；离子源温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35psi；雾化气(GS1)：55psi；辅助气(GS2)：55psi；去簇电压(DP)：60V；碰撞能量(CE)：35V；扫描方式采用全扫描一级质谱(MS)，质量采集范围100-1 000Da；全扫描二级质谱(MS/MS)，质量采集范围50-1000Da。正负离子模式下均以10mmol/L甲酸钠溶液作为质量数校正液。

所述将标准药材的特征组分质谱图添加入液相色谱质谱数据库中具体包括：在Library View数据库软件中输入每种标准药材各特征成分的名称(采用标准药材名称(序号)-特征成分名称的命名方式以期对筛查出的特征成分进行药材归属，如：淫羊藿1-淫羊藿苷、淫羊藿2-朝藿定A、淫羊藿3-朝藿定B、淫羊藿4-朝藿定C、淫羊藿5-宝藿苷Ⅰ、淫羊藿6-宝藿苷II、淫羊藿7-2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II；远志1-远志皂苷元、远志2-远志糖苷A、远志3-远志糖苷B、远志4-远志酸、远志5-细叶远志皂苷、远志6-西伯利亚远志糖A5、远志7-西伯利亚远志糖A6、远志8-远志口山酮Ⅲ、远志9-7-O-甲基杧果苷、远志10-1,2,3,7-四甲氧基口山酮；五味子1-五味子丙素、五味子2-五味子乙素、五味子3-五味子甲素、五味子4-五味子酚、五味子5-五味子醇乙、五味子6-五味子醇甲、五味子7-安五脂素(+))、英文名称、CAS号、分子式、精确相对分子质量，建立标准药材各特征成分的一级精确质量数据库；将采集的二级碎片离子图谱添加至Library View数据库软件中相应的化合物项下，由此建立标准药材各特征成分的二级碎片离子谱库，包括离子采集模式、碰撞能量和特征碎片离子信息。

最终自建质谱数据库中每种标准药材包括5-10种特征成分一级精确质量数据库和二级碎片离子谱库，共计70种中药材中434种特征组分。具体信息见表1。

下面结合本发明中的实施例，对本发明中技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：配制酒中非法添加中药材的鉴别

1.1色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore aQ色谱柱(150×2.1mm,2.6μm)；柱温：35℃；进样量：5μL；流速：0.3mL/min；正离子扫描模式流动相A为乙腈，流动相B为0.1％(v/v)甲酸水溶液；负离子扫描模式流动相A为乙腈，流动相B为超纯水；二元梯度洗脱，洗脱程序为：0-2min，5％A；2-20min，5％A-95％A；20-25min，95％A；25-26min，95％A-5％A；26-30min，5％A。

1.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI源)；

正离子扫描模式；电喷雾电压(IS)：5500V；离子源温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35psi；雾化气(GS1)：55psi；辅助气(GS2)：55psi；去簇电压(DP)：60V；碰撞能量(CE)：35V；扫描方式采用全扫描一级质谱(MS)，质量采集范围100-1 000Da；全扫描二级质谱(MS/MS)，质量采集范围50-1 000Da。

负离子扫描模式；电喷雾电压(IS)：4500V；离子源温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35psi；雾化气(GS1)：55psi；辅助气(GS2)：55psi；去簇电压(DP)：60V；碰撞能量(CE)：35V；扫描方式采用全扫描一级质谱(MS)，质量采集范围100-1 000Da；全扫描二级质谱(MS/MS)，质量采集范围50-1 000Da。

正负离子模式下均以10mmol/L甲酸钠溶液作为质量数校正液。

1.3样品处理

称取1g市售某配制酒，以10mL甲醇为提取溶剂，超声提取10min，静止30min后，取上清液过0.22μm有机滤膜，待测。

将待测样品提取液用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析。

1.4数据分析

将待测样品采集的高分辨数据导入Peak View软件，将建立好的标准药材特征成分质谱数据库化合物列表导入到Peak View软件，设置鉴别方法参数、库检索参数后进行检索匹配分析，与数据库的保留时间、精确母离子质量数、二级质谱等相关参数进行匹配。本实验在正负离子模式下，配制酒样品靶向筛查结果如表2所示，对于筛查匹配的配制酒中淫羊藿中药材特征成分，保留时间偏差在±0.2min或±5％，且母离子精确分子量与理论质量数的偏差小于20ppm，二级碎片离子质谱图与自建质谱库中质谱图匹配一致，推断该配制酒样品中加入了淫羊藿中药材。配制酒样品中淫羊藿7种特征成分与淫羊藿标准药材7种特征成分碎片离子镜像图对比如图8-图14所示，其中，每幅图中上半部分为配制酒样品中淫羊藿特征成分的碎片离子图，下半部分为标准药材中相应的淫羊藿特征成分的碎片离子图。

表2配制酒样品于自建质谱数据库靶向筛查分析结果表

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。