一种基于克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺

摘要

本发明“一种基于克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺”属于微生物技术领域。所述基于克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺的特征在于：将克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母进行混菌发酵；所述克鲁维毕赤酵母指克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11；所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的保藏号为CCTCC M 2021087。采用本发明工艺发酵得到的产品相比单菌发酵产品具有更为独特的香味，可生产出一款独特风味、香气、口感的酒饮，充实消费品类，扩大消费选择。

说明书

技术领域

本发明属于饮料发酵技术领域，具体涉及一种基于克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺。

背景技术

葡萄酒发酵是一个复杂的生物化学过程，酵母在发酵过程中起到了非常关键的作用，例如将糖转化为乙醇、二氧化碳及其他成千上万的次生代谢产物。大量科学研究表明，葡萄酒质量高度依赖于不同酵母的代谢活动及发酵行为，不同酵母对葡萄酒的化学组成、感官特性、风味特征等具有重要贡献。酿酒酵母是迄今为止在葡萄酒工业生产中应用最广的菌种，其优点在于能够保证葡萄酒发酵过程中变质的风险，且均有很好的发酵动力，但伴随而来的问题是葡萄酒风味特征单一、同质化现象严重等问题。因此，为追求葡萄酒风格特色化，香气特点更具有代表性、多样性和复杂性，酿酒师们常采用酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵的方法，尤其是一些具有很强适应性和代表性的本土酵母，从而改善和提高葡萄酒风味品质。

非酿酒酵母已经成为提高葡萄酒质量的一种选择。大量研究表明，非酿酒酵母能够产生酶以及一些我们所期望的次生代谢产物，从而提高葡萄酒香气和风味特色，并且能够控制葡萄酒中一些不良菌种的生长，但缺点是发酵动力不足。将非酿酒酵母和酿酒酵母进行混合发酵既能提高葡萄酒香气多样性和复杂性，又能弥补非酿酒酵母发酵动力不足的问题，是提高葡萄酒香气品质的有效方法。

现有技术目前存在一些将酿酒酵母和非酿酒酵母进行混菌发酵制备酒饮的报道，例如：发明专利申请202010852525.3披露了一种利用保藏编号为CCTCC NO：M 2020372的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株LI-27-1和酿酒酵母混菌发酵以降解葡萄酒中L-苹果酸的工艺。

为了提升酒饮的风味、香气，本领域亟需开发更多的混菌发酵工艺。

发明内容

基于本领域的上述需求，本发明提供一种基于克鲁维毕赤酵母菌株HSP11和酿酒酵母F33的混菌发酵工艺，相比酿酒酵母F33单菌发酵，在多种会影响酒饮风味的香气物质上均有十分显著的提升。

本发明的技术方案如下：

一种基于克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺，其特征在于，将克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母进行混菌发酵；

所述克鲁维毕赤酵母指克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11；所述克鲁维毕赤酵母 Pichia kluyveri菌株HSP11的保藏号为CCTCC M 2021087。

所述酿酒酵母指酿酒酵母菌株F33。

所述的一种基于克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺包括下述步骤：活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵。

优选地，所述菌株指：克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，或，酿酒酵母菌株 F33；

优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；

优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；

优选地，所述接种指按照体积比2-4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；

优选地，所述培养基为YPD培养基；优选地，YPD培养基包括如下质量体积比的组分： 0.5-3.5％优选1％的酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；

优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15-35％优选25％甘油/YPD培养基中；

更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次。

所述活化后的菌株指：活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，或，活化后的酿酒酵母菌株F33；

优选地，所述活化后的接入代发酵的底物进行发酵指：先将活化后的克鲁维毕赤酵母 Pichia kluyveri菌株HSP11接种于底物进行发酵0-96h，优选48h，再接种活化后的酿酒酵母菌株F33继续发酵；

优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；

优选地，活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，和，活化后的酿酒酵母菌株F33的总接种量为10

优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵；

优选地，所述底物为葡萄汁。

一种葡萄酒生产方法，其特征在于，以葡萄汁为底物，将克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母进行混菌发酵；

所述克鲁维毕赤酵母指克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11；所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的保藏号为CCTCC M 2021087。

所述酿酒酵母指酿酒酵母菌株F33。

所述的一种葡萄酒生产方法包括：活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵。

优选地，所述菌株指：克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，或，酿酒酵母菌株 F33；

优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；

优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；

优选地，所述接种指按照体积比3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；

优选地，所述培养基为YPD培养基；优选地，YPD培养基包括如下质量体积比的组分： 0.5-3.5％优选1％的酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；

优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15-35％优选25％甘油/YPD培养基中；

更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次。

所述活化后的菌株指：活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，或，活化后的酿酒酵母菌株F33；

优选地，所述活化后的接入代发酵的底物进行发酵指：先将活化后的克鲁维毕赤酵母 Pichia kluyveri菌株HSP11接种于底物进行发酵0-96h，优选48h，再接种活化后的酿酒酵母菌株F33继续发酵；

优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；

优选地，活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，和，活化后的酿酒酵母菌株F33的总接入量为10

优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵。

所述的一种葡萄酒生产方法还包括：制备葡萄汁；

所述制备葡萄汁指：将葡萄果粒低温压榨；

优选地，将采收的葡萄果粒利用气囊压榨机进行带冰压榨；

优选地，压榨同时添加二氧化硫或K

优选地，二氧化硫或K

优选地，葡萄果粒为大小均匀的果粒；

优选地，葡萄果粒为葡萄成熟后待温度下降到连续24小时-8℃以下时采收的葡萄果粒。

一种葡萄酒，其特征在于，采用所述的葡萄酒生产方法生产得到。

本发明采用克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11与酿酒酵母F33进行混菌发酵，在产生的数十种香气物质中，大多数香气物质的产量有提升，例如，二甲基硅烷二醇提高了1倍多，(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇提高了45％左右，异戊醛提高了28％，1,3-丙二醇单乙醚提高了49％左右，肉豆蔻酸乙酯提高了1倍多，壬酸乙酯提高了约80％，2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)- 吡喃-4-酮提高了约44％，2,2,4-三甲基戊二醇异丁酯提高了约36％，4-异丙基甲苯提高了近一倍；同时还产生了单菌发酵无法产生的香气物质，例如：3-甲基-1-戊醇、2-乙基己醇、丙二醇、(Z)-3-甲基-2-庚烯-1-醇、2,3-丁二酮、癸酸异戊酯、对二甲苯、(+)-苜蓿烯。上述这些香气物质的产生或它们的产量的提升均会给发酵所得饮品的风味、香气产生一定的影响，使混菌发酵产品呈现出相比单菌发酵产品具有更为独特的香味，可生产出一款独特风味、香气、口感的酒饮，充实消费品类，扩大消费选择。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步具体说明，但并不以此限制本发明的保护范围。

实验例中使用的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11为申请人实验室筛选出的新菌株，保藏信息如下：

命名：HSP11

分类名称：克鲁维毕赤酵母

拉丁名称：Pichia kluyveri

保藏号：CCTCC NO: M 2021087

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心

保藏日期：2021年1月15日；

酿酒酵母F33为商业菌株，购自法国拉氟德(Laffort)公司。

使用的葡萄品种为威代尔冰葡萄，购自宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司。

第1组实施例、本发明的混菌发酵工艺

本组实施例提供一种基于克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺。本组所有的实施例都具备如下共同特征：将克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母进行混菌发酵；所述克鲁维毕赤酵母指克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11；所述克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株HSP11 的保藏号为CCTCC M 2021087。

本领域技术人员可根据本发明的启示，任何将克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11 与酿酒酵母联用进行发酵、生产的行为均落入本发明的保护范围。发酵的目标产品包括但不限于：酒饮、发酵乳、面包等。

在具体的实施例中，所述酿酒酵母指酿酒酵母菌株F33。

本领域技术人员可根据本发明的启示，选用其他商业菌株进行混菌发酵，除F33外，目前市面上还存在多种商业菌株，例如，Saccharomyces cerevisiae V1116、Saccharomyces cerevisiae VL1、Saccharomyces cerevisiae X16等，这些菌株都可用来和本发明的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11进行混菌发酵，获得与本发明类似的技术效果。

在一些实施例中，所述的一种基于克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母的混菌发酵工艺包括下述步骤：活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵。

优选地，所述菌株指：克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，或，酿酒酵母菌株 F33；

优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；

优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；

优选地，所述接种指按照体积比2-4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；

优选地，所述培养基为YPD培养基；优选地，YPD培养基包括如下质量体积比的组分： 0.5-3.5％优选1％的酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；

优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15-35％优选25％甘油/YPD培养基中；

更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次。

在另一些实施例中，所述活化后的菌株指：活化后的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株 HSP11，或，活化后的酿酒酵母菌株F33；

优选地，所述活化后的接入代发酵的底物进行发酵指：先将活化后的克鲁维毕赤酵母 Pichia kluyveri菌株HSP11接种于底物进行发酵0-96h，优选48h，再接种活化后的酿酒酵母菌株F33继续发酵；

优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；

优选地，活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，和，活化后的酿酒酵母菌株F33的总接入量为10

优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵；

优选地，所述底物为葡萄汁。

第2组实施例、本发明的葡萄酒生产方法

本组实施例提供一种葡萄酒生产方法。本组实施例都具备如下共同特征：以葡萄汁为底物，将克鲁维毕赤酵母和酿酒酵母进行混菌发酵；所述克鲁维毕赤酵母指克鲁维毕赤酵母 Pichia kluyveri菌株HSP11；所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的保藏号为 CCTCC M 2021087。

在具体的实施例中，所述酿酒酵母指酿酒酵母菌株F33。

在另一些具体的实施例中，所述的一种葡萄酒生产方法包括：活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵。

优选地，所述菌株指：克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，或，酿酒酵母菌株 F33；

优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；

优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；

优选地，所述接种指按照体积比2-4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；

优选地，所述培养基为YPD培养基；优选地，YPD培养基包括如下质量体积比的组分： 0.5-3.5％优选1％的酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；

优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15-35％优选25％甘油/YPD培养基中；

更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次。

在具体的实施例中，所述活化后的菌株指：活化后的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株 HSP11，或，活化后的酿酒酵母菌株F33；

优选地，所述活化后的接入代发酵的底物进行发酵指：先将活化后的克鲁维毕赤酵母 Pichia kluyveri菌株HSP11接种于底物进行发酵0-96h，优选48h，再接种活化后的酿酒酵母菌株F33继续发酵；

当先将活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11接种于底物进行发酵的时间为0h时，表活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11和活化后的酿酒酵母菌株 F33可同时接种于底物进行发酵直至底物失重连续3天不再变化终止发酵。

优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；

优选地，活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，和，活化后的酿酒酵母菌株F33的总接入量为10

优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵。

在进一步的实施例中，所述的一种葡萄酒生产方法还包括：制备葡萄汁；

所述制备葡萄汁指：将葡萄果粒低温压榨；

优选地，将采收的葡萄果粒利用气囊压榨机进行带冰压榨；

优选地，压榨同时添加二氧化硫或K

优选地，二氧化硫或K2S2O5的添加量为30-100mg/L优选50mg/L；果胶酶的添加量为 10-30mg/L优选20mg/L；

优选地，葡萄果粒为大小均匀的果粒；

优选地，葡萄果粒为葡萄成熟后待温度下降到连续24小时-8℃以下时采收的葡萄果粒。第3组实施例、本发明的葡萄酒

本组实施例提供一种葡萄酒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用第2组实施例任一项所述的葡萄酒生产方法生产得到。

本发明的葡萄酒产生下述单菌发酵的葡萄酒无法产生的香气物质：3-甲基-1-戊醇、2-乙基己醇、丙二醇、(Z)-3-甲基-2-庚烯-1-醇、2,3-丁二酮、癸酸异戊酯、对二甲苯、(+)-苜蓿烯，同时在下述香气物质的含量上远高于单菌发酵的葡萄酒：二甲基硅烷二醇，(2R,3R)-(-)-2,3- 丁二醇，异戊醛，1,3-丙二醇单乙醚，肉豆蔻酸乙酯，壬酸乙酯，2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基 -4(H)-吡喃-4-酮，2,2,4-三甲基戊二醇异丁酯，4-异丙基甲苯。

实验例、本发明的混菌发酵工艺及发酵数据

1.菌株

本试验采用的菌株为：商业酿酒酵母S.cerevisiae F33和本发明分离筛选的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11。

2.葡萄汁

威代尔冰葡萄原料种植于宁夏省银川市永宁县玉泉营，宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司(E106.02°，N38.24°)。葡萄树种植于2013年，采用小棚架栽培，株行距为1.0m×2.0m，本试验于2017年采收，葡萄成熟后不采摘，待温度下降到连续24小时-8℃以下时采摘，去除小次果粒，随机选择大小一致的冰葡萄果实低温压榨。对采收后的冰葡萄通过气囊压榨机进行带冰压榨操作，同时添加二氧化硫(50mg/L K

3.发酵操作

2种菌株：酿酒酵母S.cerevisiae F33菌株、克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11 在使用前均保存于体积比25％甘油/YPD培养基中。YPD培养基为1％酵母浸粉、2％蛋白胨、 2％葡萄糖。按照体积比3％的接种量分别接种于装有40mL YPD培养基的50mL三角瓶中和装有150mL YPD培养基的250mL三角瓶中，培养温度为28℃,转速为150rpm，培养时间为24h，得到第1次活化的菌液，再按照3％的接种量分别接种于装有40mL YPD培养基的50mL三角瓶中和装有150mL YPD培养基的250mL三角瓶中重复上述培养，完成第2次传代活化，即得到活化后的菌液。先将活化后的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11接入已收集好的葡萄汁中，48小时后，按照HSP11/F33的体积比为2:1的接种比例，接入S.cerevisiae F33菌株，菌株的总接种量控制在6×10

4.香气物质的定量方法

采用顶空-固相微萃取法-气相质谱法(HS-SPME-GC/MS)。准确量取8mL葡萄酒样品加入含有1.5g NaCl顶空瓶中，同时394.08μg/L 4-甲基-1-戊醇(内标物)，加盖密封。插入CAR/DVB/PDMS萃取纤维，45℃下吸附30min后将萃取纤维在GC进样口250℃下解吸3 min，进行GC-MS分析。色谱柱：InertCap WAX极性色谱柱(60m×0.25mm，0.25μm)；升温程序为：40℃保持5min，以3℃/min升至120℃，再以8℃/min升至230℃，保持10min；载气(He)流速0.8mL/min，不分流。电子轰击离子源；电子能量70eV；传输线温度275℃；离子源温度230℃；激活电压1.5V；灯丝流量0.25mA；质量扫描范围m/z 33～450。采用外标定量法进行化合物定量分析。

5.数据分析方法

所有样品均分别平行测定3次取平均值。使用SPSS 22.0for Windows(SPSS Inc.，Chicago,IL,US)进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan`s多范围检验(P<0.05)；Unscrambler 9.7(CAMO ASA,Norway)进行偏最小二乘法分析。

最终统计整理得到下表1，表中数据的单位为μg/L，含义：每升葡萄酒中该香气物质的含量。

表1

上表1中的香气阈值指人类可以嗅闻到该物质的最低浓度下限值，香气描述和阈值均以记载有该类香气物质的香气描述和阈值的相关文献报道为准，表中无香气描述和阈值的香气物质则是未检索到有关该物质的香气描述和阈值的相关记载的文献。表头中的“F33”指采用商业菌株-酿酒酵母F33单菌发酵的数据，“F33_HSP11”指采用商业菌株-酿酒酵母F33和克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11混菌发酵的数据。

发酵领域公知，影响发酵的因素众多且复杂，发酵后的产品成分会因原料批次、原料成分、发酵条件、温度、时间等因素的变化而变化，因此也会出现在某些香气成分上单菌发酵高于混菌发酵的情况，这在本领域属正常现象。