一种基于LAMP的纳米材料及其应用于食品耐药金黄色葡萄球菌的可视化检测方法

摘要

本发明公开了一种基于LAMP的纳米材料及其应用于食品耐药金黄色葡萄球菌的可视化检测方法，属于病原分子检测技术领域，所述基于LAMP的纳米材料包括合成并优化自组装PDA材料；所述可视化检测方法包括引物设计、细菌样品基因组提取、LAMP反应体系建立等，其中，所述LAMP检测靶标包括由金葡菌基因组中筛选的特异性基因SAOUHSC_01275，可在常见食源性致病菌中特异性识别出金葡菌，另一个靶标是由实际牛奶中筛选得到的大环内酯类抗生素的耐药基因MacB；还包括所述引物在制备检测食品耐药金黄色葡萄球菌特异性管家基因SAOUHSC_01275和介导大环内酯类抗生素耐药的MacB基因的试剂中的应用及与之对应的试剂盒。本发明具有制作简单、检测便捷、成本效益高等优点，以实现对食品中耐药金葡菌的快速现场筛查和鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及病原分子检测技术领域，具体涉及一种基于LAMP的纳米材料及其应用于食品耐药金黄色葡萄球菌的可视化检测方法。

背景技术

抗生素自上个世纪首次使用以来，已经给全球的公共卫生系统带来诸多益处，随着抗生素在临床治疗和畜牧业养殖中的过度使用，又引发了新的公共卫生问题。金黄色葡萄球菌作为一种常见的食源性致病菌，是临床上分离率排名居首的革兰氏阳性致病菌，其耐药性问题无论是对食品安全还是对人类健康都带来极大威胁，尤其是现在食品中金葡菌的耐药性问题还尚未引起人们的足够重视，根据国家标准(GB29921-2013)规定，肉制品、水产制品、粮食制品、果蔬制品及饮料中金葡菌的限量标准为每25g或25mL不超过1000CFU/g，世界范围内由金葡菌超标引起的食品安全事件时有报道，然而对于低于限量标准以下金葡菌的耐药性却并未涉及。因此，快速、准确对食品中金葡菌的耐药性进行可视化检测和鉴定对生产者、消费者和市场监管部门意义重大。

目前国际上和国内对细菌耐药性的检测和鉴定主要依赖于以细菌抗生素敏感性检测为基础的耐药表型鉴定技术和以细菌耐药基因检测为基础的基因鉴定技术。前者操作繁琐、耗时较长、结果获取延迟，而后者检测技术虽然众多，但缺乏标准化、规范化，不同类型细菌之间的耐药基因同源性较高、非特异性交叉反应时常存在，引物、探针、特异性序列的设计没有统一的评判标准，通常需要借助一些仪器设备才能进行扩增和检测，耗时较长，无法满足现场对耐药细菌的快速可视化检测和鉴定，严重制约了对食品中耐药金葡菌的快速监测和监管，因此亟待建立能够真正实现食品中耐药金葡菌的现场可视化快速检测方法或研制相应的检测产品。

环介导等温扩增法(Loop mediated isothermal amplification method,LAMP)是一种全新的核酸扩增方法，目前在分子生物学检测领域的应用非常广泛。该方法能在在链置换DNA聚合酶的作用下60-65℃恒温反应，经15-60分钟左右即可实现10

聚联乙炔(Polydiacetylene,PDA)是一类由有序排列的联乙炔分子，在紫外光照射下，通过1,4-加成反应聚合而成的、具有共轭离域键的聚合物。PDA 在外界条件(如：温度、pH、机械应力、离子、免疫反应等)的刺激下，可表现出特殊的颜色变化(由蓝变红)，故自组装PDA纳米材料能够实现快速可视化检测，并且检测过程无需复杂荧光标记和借助昂贵的仪器，在病毒、细菌、蛋白质和寡核苷酸等检测中具有广阔的应用前景。

发明内容

鉴于解决现有技术缺陷的目的，本发明提出一种基于LAMP的纳米材料及其应用于食品耐药金黄色葡萄球菌的可视化检测方法，以提供一种制作简单、检测便捷、成本效益高的快速检测方法，实现对食品中耐药金葡菌的快速现场筛查和鉴定。

本发明的目的在于提供一种可用于指示LAMP体系反应产物的PDA自组装材料的制备及其优化方法。根据金黄色葡萄球菌特异性管家基因 SAOUHSC_01275和介导大环内酯类抗生素耐药的MacB基因设计LAMP反应体系，将优化的PDA自组装材料与LAMP反应产物反应后可以通过目测材料的红蓝颜色变化指示LAMP反应的发生与否，蓝色表明LAMP扩增效率较高，紫色或红色代表LAMP反应效率低或不发生。

本发明第二个目的在于提供一种可用于可视化检测食源性耐药金葡菌的靶标基因和方法。根据介导大环内酯类抗生素耐药的MacB基因设计了基于 LAMP-PDA的可视化检测方法，所述方法可以实现对食源性耐药金葡菌的靶标基因的可视化检测，反应溶液为蓝色说明LAMP反应效率高，样品测试结果为阳性；当溶液为紫色或红色代表LAMP反应效率低或不发生，样品浓度较低或为阴性。该方法克服了传统核酸检测技术的仪器依赖性，具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点。所述方法可以用于在现场和基层快速筛查食源性耐药金葡菌。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于LAMP的纳米材料，所述纳米材料为PDA材料。

优选地，所述PDA材料由10,12-二十五碳二炔酸和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱与有机溶剂混合制备得到，得到PDA囊泡分散液。

优选地，所述10,12-二十五碳二炔酸和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的摩尔比为5:5～10。

优选地，所述检测方法包括引物设计、细菌样品基因组提取及LAMP反应体系建立，所述LAMP反应体系可扩增出LAMP产物，即可用所述PDA材料指示其扩增效果。

优选地，所述可视化检测靶标基因为：金葡菌的特异性管家基因 SAOUHSC_01275和介导大环内酯类抗生素耐药的MacB基因，从GenBank数据库中下载所述金葡菌的SAOUHSC_01275和MacB基因序列。

优选地，(1)所述引物包括内引物、外引物及环引物：

其中，对于SAOUHSC_01275基因，

所述外引物为SAOUHSC_01275 F3和SAOUHSC_01275 B3；

所述内引物为SAOUHSC_01275 FIP和SAOUHSC_01275 BIP；

所述环引物为SAOUHSC_01275 Loop F和SAOUHSC_01275 Loop B；

所述引物序列自5’端到3’端如下(见表3)：

SAOUHSC_01275 F3 AGAGAAGTGCTGCGAATGG

SAOUHSC_01275 B3 GCACCTAACATTTGAGCAACAAT

SAOUHSC_01275 FIP ACCTGAGAATTGACCGACAGCAATGATTGGATTGTCATCACAGCT

SAOUHSC_01275 BIP GCACATTTAAACCCAGCGGTGTAACCAGGAACTAATGACCAATCAA

SAOUHSC_01275 Loop F ACCCATTGTAACCGCTAATCC

SAOUHSC_01275 Loop B AGCTCTTGCATTAGACGGAAG；

其中，对于MacB基因，

所述外引物为MacB F3和MacB B3；

所述内引物为MacB FIP和MacB BIP；

所述环引物为MacB Loop F和MacB Loop B；

所述引物序列自5’端到3’端如下(见表3)：

MacB F3 CCGGTAAATCGACCCTGATG

MacB B3 GCTCAAGACCAGCATAGACG

MacB FIP GTGGCAACATCCTGACCGGCTCGGCTGTCTGGATAAGGC

MacB BIP GCCGCGAGCATTTCGGCTTTACGGGTACTTCAACGTTCTGC

MacB Loop F ACGCGATAGGTGCCGCTGGT

MacB Loop B CCAGCGTTACCATTTGCTTTCGC；

(2)所述细菌样品基因组提取样品包括但不限于野生型金葡菌、耐药金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特杆菌；

(3)所述LAMP反应体系建立包括利用Bst酶的循环链置换反应，采用25 μL的反应总体系，其成分包括1.25μL 10×Isothermal Amplification Buffer， 3.5μL 10mM dNTPs(体系中终浓度为1.4mM)，1.5μL 100mM MgSO

优选地，所述LAMP-PDA检测体系10×Isothermal Amplification Buffer浓度为30％～70％；所述LAMP-PDA检测耐药金葡菌的灵敏度分析步骤包括：对提取的基因组DNA用微量核酸定量仪进行定量，其浓度为115.6ng/μL，之后将梯度系列稀释，依据所述LAMP-PDA的方法，将不同浓度稀释的2μL耐药金葡菌的DNA模板于LAMP体系进行反应，最终的DNA浓度为9.248×10

优选地，所述LAMP-PDA体系检测实际样品的特异性步骤包括任何牛奶及其制品。

优选地，所述的检测食品耐药金黄色葡萄球菌特异性管家基因 SAOUHSC_01275和介导大环内酯类抗生素耐药的MacB基因引物在制备检测食品耐药金黄色葡萄球菌特异性管家基因SAOUHSC_01275和介导大环内酯类抗生素耐药的MacB基因的试剂中的应用。

优选地，所述应用于食品耐药金黄色葡萄球菌特异性管家基因 SAOUHSC_01275和介导大环内酯类抗生素耐药的MacB基因检测的试剂盒。

相对于现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：

第一，本发明系统制备和优化了自组装PDA材料，并首次将其用于LAMP 产物指示剂。首先，通过优化PDA囊泡显色指示液中主要试剂的摩尔比例，实现该指示剂在外界刺激下最大化的颜色差异。其次，在建立LAMP体系的过程中验证了金葡菌特异性管家基因在不同食源性致病菌中的特异性，通过优化LAMP反应体系中buffer关键因素和PDA显色指示液的反应比例，从而实现在不同食源性致病菌中可视化识别耐药金葡菌，检测结果与琼脂糖凝胶电泳一致，说明该方法准确可靠。

第二，本发明通过LAMP体系实现信号放大，依靠PDA显色指示液实现信号输出，直接通过目视红蓝变色即可直观判断是否有金葡菌以及耐药基因的存在。该方法灵敏度较高，检测下限可达到9.248×10

第三，本发明的LAMP-PDA反应体系无需复杂的生物化学修饰，无需加入荧光染料，无需任何大型仪器和紫外光源等，检测结果肉眼可辨、成本较低，且LAMP试剂和PDA可冻成干粉，易于存放和携带，便于后续制备试剂盒，可适用于现场和基层对食品中耐药金葡菌的快速现场筛查和鉴定。

附图说明

图1示出了合成并优化自组装PDA材料的表征：A、B为不同PDA经碱性溶液刺激后的颜色变化及色变程度；C、D为PDA经碱性溶液刺激前后的扫描电镜图。

图2示出了本发明实施例中对金葡菌SAOUHSC_01275基因关于不同食源性致病菌特异性的验证。模板分别为：野生型金葡菌、耐药金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特杆菌以及阴性对照。阴性指不加入任何基因组的无菌水。

图3示出了基于LAMP-PDA体系检测不同食源性致病菌特异性。泳道从左到右分别为2000bp Marker、野生型金葡菌、耐药金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特杆菌以及阴性对照。阴性指不加入任何基因组的无菌水图。

图4示出了LAMP-PDA体系中buffer浓度优化(A)和常规pH试纸指示 LAMP反应结果(B)。

图5示出了基于LAMP-PDA体系检测耐药金葡菌的灵敏度。泳道M为 2000bpMarker，泳道1-11的终浓度为1:9.248ng/μL；2:9.248×10

图6示出了常规PCR方法检测食源性耐药金葡菌的监测灵敏度。泳道M 为2000bpMarker，泳道1-11的终浓度为1:9.248ng/μL；2:9.248×10

图7示出了基于LAMP-PDA体系检测实际样品。泳道M为2000bp Marker，泳道1-3号分别为阳性牛奶样本1、2、3号；泳道4、5为阳性牛粪样品1、2 号；泳道6-8分别为市售伊利袋装牛奶、蒙牛袋装牛奶、德运脱脂纯牛奶；泳道9为无菌水。

具体实施方式

为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。除非另有说明，否则本发明中涉及的技术术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。

本实施例用于说明本发明的自组装PDA材料的制备和优化。

一、实验方案设计

1.制备自组装PDA：准确称取26.2mg PCDA和20.3mg DMPC于10mL 氯仿的烧瓶中，避光搅拌2h；将上述溶液在旋转蒸发仪或者氮吹仪上除去溶剂，瓶底形成一层淡粉色薄膜，量取20mL超纯水加入烧瓶，充分混合后用 20％功率的超声波分散仪超声分散20min；分散完毕后形成PDA分散液，将其混合均匀，在4℃条件下避光保存至少6h；然后经紫外照射进行聚合，得到PDA分散液。

2.改变实施例1中PCDA/DMPC的摩尔比，测试不同摩尔配比下(10、 9/1、8/2、7/3、6/4)制备的PDA在pH＝9的碱性条件下响应前后的颜色和CR 值变化。

二、结果分析

结果如图1A、B所示，可见，将10,12-二十五碳二炔酸和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱以7/3的摩尔比例混合制得的PDA对组胺的响应更为灵敏，变色程度和范围更大。图1C、D分别为经碱性溶液刺激前后的扫描电镜图，标尺为2 μm，可见，反应前的PDA为粒径均一的圆球状，较为分散，反应后的颗粒聚集明显，说明经过pH干扰PDA结构确实发生变化从而导致其颜色发生变化。

本实施例用于说明本发明的PDA用于可视化检测靶标基因。

一、实验方案设计

1.引物设计：所述可视化检测靶标基因为：金葡菌的特异性管家基因 SAOUHSC_01275和介导大环内酯类抗生素耐药的MacB基因，从GenBank数据库中下载金葡菌的SAOUHSC_01275和MacB基因序列，并对靶标基因的特异性进行验证。

2.细菌样品基因组提取：按照GB/T 4789.10-2016的方法进行样品制备和增菌，将增菌后的培养物划线接种至血平板，过夜培养后，挑取单克隆菌落于 25μL无菌水中，沸水浴15min后作为模板待检。所用样品包括野生型金葡菌、耐药金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特杆菌。

3.LAMP反应体系建立：利用Bst酶的循环链置换反应，采用25μL的反应总体系，其成分包括1.25μL 10×Isothermal Amplification Buffer，3.5μL 10 mM dNTPs(体系中终浓度为1.4mM)，1.5μL 100mM MgSO

表1 10×LAMP引物工作液的配置

表2 LAMP反应体系的配置

4.LAMP反应结果分析

首先取10μL上述LAMP反应产物进行常规琼脂糖凝胶电泳分析LAMP 反应结果。其次，加入上述优化的15μL PDA显色指示液，在5min内观察溶液颜色变化。

二、结果分析

1.引物设计

结果如图2所示，可见只有金黄色葡萄球菌组的DNA出现特异性条带，而其他细菌和对照均无条带产生，说明靶标基因特异性较好。通过筛选和比对上述两个基因的特异性保守序列，分别设计3对LAMP的特异性引物(外引物F3/B3、内引物FIP/BIP及环引物Loop F/Loop B)识别序列上的六个独立区域，引物序列如表3所示：

表3 LAMP的特异性引物组和常规PCR引物组

2.LAMP反应结果分析

由图3可知，样品含有目的基因时，电泳结果会出现相应的阶梯状条带，而不含目的基因组没有该条带产生。当有目的基因存在并LAMP反应成功发生时，溶液为蓝色；当没有目的基因存在时，溶液为红色。上述常规凝胶电泳与LAMP-PDA检测方法结果一致，说明本发明所述方法准确可靠。

本实施例用于说明基于本发明的LAMP-PDA体系可视化快检食品中耐药金葡菌。

一、实验方案设计

1.LAMP-PDA检测体系优化：由于buffer的pH值对于PDA显色结果有一定的影响，故需对其进行优化，在上述LAMP体系中调整10×Isothermal Amplification Buffer的浓度，即分别加入1.25μL 30％、50％、70％浓度的buffer，其余步骤同实施例2步骤(3)，进行LAMP反应。通过对反应产物用琼脂糖凝胶电泳分析和PDA显色指示液的变色程度进行优选buffer浓度，并将测试结果与常规pH试纸进行对比。

2.LAMP-PDA检测耐药金葡菌的灵敏度分析：对提取的基因组DNA用微量核酸定量仪进行定量，其浓度为115.6ng/μL，之后将梯度系列稀释，按上述 LAMP-PDA的方法，将上述不同浓度稀释的2μL耐药金葡菌的DNA模板于 LAMP体系进行反应，最终的DNA浓度为1:9.248ng/μL；2:9.248×10

3.常规PCR检测耐药金葡菌的灵敏度分析：配置常规PCR体系(见表 4)，将上述LAMP反应所用2μL模板分别加入PCR反应体系混合液48μL 做好标记进行PCR扩增。反应结果用琼脂糖凝胶电泳表征，并与LAMP-PDA 反应体系对比分析检测灵敏度。

表4 PCR反应体系

表5 PCR反应条件

4.LAMP-PDA体系检测实际样品的特异性：使用常规方法提取各种阳性牛奶样本1、2、3号和牛粪样品1、2号作为模板，应用本发明所述的LAMP- PDA检测体系分别进行检测，观察其特异性。

二、结果分析

1.由图4A可知，50％的buffer对于LAMP-PDA反应的变色响应程度最大，图4B为pH试纸对该反应结果的颜色指示，结果同样表明反应前后的pH 值确有下降，但常规pH试纸的颜色差异没有本发明所述方法直观明显。

2.LAMP-PDA检测耐药金葡菌的灵敏度分析：由图5可知，LAMP-PDA 体系在靶基因浓度低至9.248×10

3.常规PCR检测耐药金葡菌的灵敏度分析：如图6所示，PCR检测方法只能达到9.248×10

4.LAMP-PDA体系检测实际样品的特异性：表6、图7结果表明，用该方法测定的来源于本地超市购买的牛奶结果全为阴性。检测已知的受耐药金葡菌污染的样品，结果全为阳性，说明本方法可以快速准确鉴别食品中耐药金葡菌的污染情况。

表6 LAMP-PDA体系检测实际样本的特异性结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。