环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测食品中金黄色葡萄球菌的研究

摘要

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)简称金葡菌,是食品中常见的污染菌,该菌认为是引起细菌性食物中毒最普遍的因为之一。国内外由金葡菌引发的食物中毒屡屡发生,金葡菌所引起的食物中毒已日益成为全球性的公共卫生问题,严重危害人类安全与健康。因而,应该建立一种方便快捷的检测金葡菌的方法是食品安全问题中的一项重要的举措,可以起到防患于未然。
　　 目前针对金葡菌的检测方法主要有传统检测方法,免疫学方法和PCR方法。传统检测方法操作繁琐,检测时间长,且灵敏度较低；免疫学方法的特异性和灵敏度也不是很理想,PCR方法敏感、快速,但是由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程,而使其难以在基层普及和推广。
　　 环介导等温扩增方法(LAMP)是一种由日本科学家Notomi开发的新型的核酸扩增技术,可以扩增特异性核酸序列,具有高特异性、高灵敏性,简便快速和成本低的特点,已在诸多领域广泛应用。
　　 本试验是采用环介导等温扩增技术快速检测食品中金葡菌。以金葡菌的高度保守序列-耐热核酸酶nuc序列为靶基因,运用在线引物设计软件(https:／／primerexplorer.jp／lamp3.0.0／index.html)设计LAMP引物。对镁离子浓度、dNTPs浓度、反应时间等扩增条件进行优化,确定25μL的LAMP反应体系为:内引物(FIP和BIP)各1.6mmol／L,外引物(F3和B3)各0.4mmol／L,环引物(LB和LF)各0.8mmol／L,4.0mmol／L dNTPs,3mmol／L MgSO4,10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液,8U的Bst DNA聚合酶大片段,2.5μL DNA模板,并用灭菌双蒸水补足体系。LAMP的反应过程为:先在64℃水浴锅中反应20min,然后在80℃水浴锅中水浴10min终止反应。反应结束后,通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀即可判断LAMP反应是否发生,亦可通过琼脂糖凝胶电泳证实反应是否发生。
　　 为了比较LAMP检测金葡菌的灵敏度和人工污染检出限,以PCR方法作对照。PCR反应的引物是[AMP反应的两条外引物(F3和B3)。结果表明,LAMP检测金葡菌的灵敏度为1.25CFU／反应管(2.5x101CFU／mL),人工污食品的检出限为10.3CFU／反应管(2.06×102CFU／mL)。PCR检测金葡菌的灵敏度为1.25×102 CFU／反应管(2.5×103CFU／mL),人工污染食品的检出限为1.03×103 CFU／反应管(2.06x104CFU／mL)。采用试剂盒法提取DNA,从样品处理到报告结果,LAMP方法耗时1h,PCR方法耗时3h。利用LAMP方法对40株肠道致病菌进行特异性试验。结果表明,24株金葡菌为阳性,其它16株非金葡菌为阴性。
　　 初步研究了8种模板制备方法对LAMP检测食品中金葡菌的影响。结果表明,LAMP方法对制备模板DNA的要求不高。通过对实际样品进行检测,将本方法与国家标准GB／T4789.10-2010方法进行比较,确定LAMP方法敏感性为100％,特异性为97.93％,符合率为98.5％。
　　 研究表明,本研究建立的LAMP法检测食品中金葡菌的方法具有特异性强、灵敏度高,方便快捷、成本低等特点,为金葡菌的检测提供了新的发展方向,并且由于该检测方法有操作简单,不需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程,快速省时等优点,更利于一些基层检验检疫机构的应用,LAMP法有望成为简易的常规检测手段,对于提高食品卫生水平、保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 立题背景及意义

1.2 金葡菌的简介

1.2.1 金葡菌的发现历史

1.2.2 金葡菌的基本特征

1.2.3 金葡菌的致病性

1.2.4 金葡菌的流行病学

1.2.5 金葡菌食物中毒

1.2.6 与金葡菌食物中毒相关的食物

1.2.7 金葡菌污染的控制

1.3 金葡菌检测方法研究现状

1.3.1 传统分离鉴定方法

1.3.2 快速鉴别培养基

1.3.3 微型化生化试剂盒

1.3.4 免疫学检测方法

1.3.5 分子生物学检测方法

1.3.6 其他检测方法

1.4 环介导等温扩增(LAMP)技术

1.4.1 LAMP法的概述

1.4.2 LAMP法的特点

1.4.3 LAMP法的引物设计

1.4.4 LAMP法的基本原理

1.4.5 LAMP的反应体系

1.4.6 LAMP法产物的检测方法

1.4.7 LAMP法的应用

1.5 研究内容

2 材料与方法

2.1 试验材料与仪器

2.1.1 试验菌株

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 主要培养基

2.1.4 生化试剂

2.1.5 试验样品

2.2 试验方法

2.2.1 菌种的保藏、活化和培养

2.2.2 细菌DNA模板的提取

2.3 LAMP引物设计、反应体系及主要操作

2.3.1 引物设计

2.3.2 LAMP和PCR反应体系

2.3.3 LAMP和PCR主要操作程序

2.4 LAMP反应条件优化

2.4.1 适宜镁离子浓度选择

2.4.2 Bst DNA聚合酶对试验结果的影响

2.4.3 适宜dNTPs浓度选择

2.4.4 反应时间的优化

2.4.5 反应温度的优化

2.4.6 引物对LAMP反应的影响分析

2.4.7 甜菜碱LAMP反应的影响

2.5 LAMP引物特异性的检测

2.6 金葡菌的灵敏度检测

2.6.1 LAMP反应的灵敏度检测

2.6.2 PCR反应的灵敏度检测

2.7 LAMP扩增产物的分析

2.7.1 LAMP扩增产物的可视结果分析

2.7.2 LAMP扩增产物的凝胶成像分析

2.7.3 LAMP扩增产物酶切结果分析

2.8 人工污染食品中金葡菌基因组DNA提取方法比较

2.8.1 溶剂提取热裂解法

2.8.2 FDA提取DNA法

2.8.3 化学试剂法

2.8.4 溶剂提取酶解法:

2.8.5 试剂盒法

2.8.6 FTA滤膜法

2.8.7 蛋白酶K法

2.8.8 普通热裂解法

2.9 人工污染金葡菌食品的检测试验

2.9.1 人工污染肉及肉制品样品中金葡菌DNA的提取、检测

2.9.2 人工污染乳品样品中金葡菌DNA的提取、检测

2.10 实际样品检测试验

3 结果与分析

3.1 LAMP反应条件的优化

3.1.1 镁离子浓度的优化

3.1.2 Bst DNA聚合酶的优化

3.1.3 dNTPs浓度的优化

3.1.4 反应时间的优化

3.1.5 反应温度的优化

3.1.6 引物缺省试验

3.1.7 甜菜碱对LAMP反应的影响

3.2 LAMP引物特异性的研究

3.3 LAMP扩增产物的分析

3.4 食品中金葡菌DNA提取方法的比较

3.5 LAMP和PCR检测金葡菌的灵敏度

3.6 人工污染食品中金葡菌检出限的研究

3.7 实际食品样品LAMP检测试验

4 讨论

4.1 环介导等温扩增(LAMP)方法检测金葡菌方法学评价

4.2 靶基因的选择

4.3 LAMP引物的确定

4.4 LAMP反应条件的优化

4.4.1 DNA聚合酶

4.4.2 镁离子浓度

4.4.3 dNTPs浓度

4.4.4 温度对LAMP的影响

4.5 食品中金葡菌提取方法的比较

4.6 LAMP方法实际样品检测试验

4.7 LAMP方法发展展望

5 结论

参考文献

附录 A

硕士期间发表学术论文

作者简介

致谢