一种鉴定徐海鸡种的方法及试剂盒

摘要

本发明涉及家禽遗传育种、生物技术领域，具体涉及一种鉴定徐海鸡种的鉴定方法及试剂盒。本发明在筛选得到徐海鸡特异性遗传位点的基础上，进一步对所得遗传位点进行优化筛选，筛选所得XH_tag1‑XH_tag16所述遗传特异性位点用于徐海鸡鉴定准确率均在85％以上，为今后徐海鸡的品种资源保护与鉴定、食品溯源提供支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及家禽遗传育种、生物技术领域，具体涉及一种鉴定徐海鸡种的鉴定方法及试剂盒。

背景技术

徐海鸡是江苏北部地区著名的肉蛋兼用型地方品种，中心产区在徐州至海州(属连云港市)一带，淮安、临沂、枣庄、日照、济宁等地也有分布。徐海鸡饲养历史悠久，长期选择造就了既能适应当地养殖环境又能满足消费需求的宝贵鸡种遗传资源。该鸡特有的外貌特征主要体现在：1)从胫部至趾部长有羽毛，故徐海鸡也称“毛脚鸡”；2)跗关节如同秃鹫一样附有长长的向下的羽毛；3)成年母鸡长距。近年来，随着高产商品化品种的冲击及地方鸡种资源保护意识的缺乏，徐海鸡已濒临灭绝。江苏省家禽研究所自2010年开始收集整理徐海鸡遗传资源，徐海鸡生产性能得以提高，并于2016年开始将徐海鸡逐批返回原产地饲养。为更好的了解和保护这一宝贵的品种资源，防止养殖户使用徐海鸡乱交乱配，以及品种、知识产权认定问题，提供一种徐海鸡品种有效鉴定方法是亟需的。

随着牛、绵羊、猪和鸡基因组数据的公开，SNPs标记为家养动物遗传多样性研究提供更多信息，推动品种特异性遗传标记研究成为当前畜禽遗传资源研究的靓点和热点。品种特异性遗传标记不仅用于区分和提纯品种，还用于鉴别个体、食品溯源。多种方法用于筛选品种特异性遗传标记，其中较为常见的包括DELTA、对比群体固定系数、分配信息、特征选择(FIFS)以及最小等位基因频率-连锁不平衡(MAF-LD)。简化基因组测序被认为是过去十年来一项重要的科学突破，其原理是利用限制性内切酶对基因组进行有限酶切，然后高通量测序。不同国家多个团队应用简化基因组技术进行畜禽遗传多样性研究。

随着研究的不断进行，发明人发现地方鸡种的特异性位点可能有多个，而在实际测序判断中，并不是所有的特异性位点都能有效地将所述家禽品种与其它品种区分开。主要原因可能在于特异性标记在不同群体的分布频率不同，不同位点所在基因片段准确复制的难易程度不同，或者用于扩增的引物的特异性不同。因而，需要优化特异性位点组合、筛选特异性较高的引物。

基于此，提供一种更为准确的徐海鸡种的鉴定方法，是目前所需的。

发明内容

本发明主要目的是提供一种鉴定徐海鸡种的方法及试剂盒。本发明在筛选得到徐海鸡特异性遗传位点的基础上，进一步对所得遗传位点进行优化筛选，筛选所得遗传位点用于徐海鸡鉴定准确率均在85％以上。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一，提供一种鉴定徐海鸡种的方法，利用以下任意一个或几个特异性遗传位点进行鉴定：

XH_tag1位于1号染色体2096845处，EXOC4基因第14内含子，徐海鸡基因型为--(突变基因型为AGA//AGA)；

XH_tag2位于1号染色体37685187处，TRHDE基因与KCNC2基因之间，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag3位于1号染色体109648385处，DSCAM基因第3内含子，徐海鸡基因型为TT；

XH_tag4位于2号染色体62783242处，HIVEP1基因第3内含子，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag5位于2号染色体103201782处，LAMA3基因第43内含子，徐海鸡基因型为CC；

XH_tag6位于2号染色体107529257处，DTNA基因第24内含子，徐海鸡基因型为TT；

XH_tag7位于3号染色体9906477处，EHBP1第11内含子，徐海鸡基因型为TT；

XH_tag8位于3号染色体16349484处，MRPS5基因与SLC8A1基因之间，徐海鸡基因型为GG；

XH_tag9位于5号染色体37248844处，MIPOL1基因第8内含子，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag10位于5号染色体37593563处，LOC112532542基因下游，徐海鸡基因型为CC；

XH_tag11位于6号染色体16029996处，ADK基因第4内含子，徐海鸡基因型为GG；

XH_tag12位于8号染色体4589172处，NOTCH2基因第10内含子，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag13位于9号染色体10221459处，TRIP12基因第1内含子，徐海鸡基因型为CC；

XH_tag14位于13号染色体14469791处，ADAMTS2基因第4内含子，徐海鸡基因型为GG；

XH_tag15位于13号染色体18390747处，基因KCTD16与基因SH3RF2之间，徐海鸡基因型为--(野生基因型为AA)；

XH_tag16位于18号染色体3561395处，LOC427799基因第1内含子，徐海鸡基因型为AA；

以上所述标记染色体物理位置以鸡全基因组GallusgallusGRCg6作为参考基因组对比后确定。但标准序列基因组版本号不局限为GallusgallusGRCg6这一种，不论采用哪种所述鸡全基因组标准序列的版本号，只要是涉及的SNPs位点或INDELs位点与本发明以上所述16个SNPs位点或INDELs位点相同，均落入本发明的保护范围。

进一步地，利用以下任意一个或几个特异性遗传位点进行鉴定：

XH_tag4位于2号染色体62783242处，HIVEP1基因第3内含子，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag6位于2号染色体107529257处，DTNA基因第24内含子，徐海鸡基因型为TT；

XH_tag7位于3号染色体9906477处，EHBP1第11内含子，徐海鸡基因型为TT；

XH_tag10位于5号染色体37593563处，LOC112532542基因下游，徐海鸡基因型为CC；

XH_tag13位于9号染色体10221459处，TRIP12基因第1内含子，徐海鸡基因型为CC。

进一步地，以上所述特异性遗传位点通过将徐海鸡与济宁百日鸡、琅琊鸡、寿光鸡、汶上芦花鸡、如皋黄鸡、鹿苑鸡、狼山鸡、溧阳鸡、太湖鸡、龙胜凤鸡、闽清毛脚鸡、淮北麻鸡对比分析得到。

进一步地，扩增XH_tag4遗传位点所用引物为：正向引物XH_P4f：CGTCGCTCCAAGATACAA；

反向引物XH_P4r：TCACAGAGAAGCATCCTAAG；

进一步地，扩增XH_tag6遗传位点所用引物为：

正向引物XH_P6f：GTGTCTTCAGATGTGTTGTG；

反向引物XH_P6r：CCAGAACTTGTAGAACTCTTG；

进一步地，扩增XH_tag7遗传位点所用引物为：

正向引物XH_P7f：ATTGTGAACCAGCAGCAT；

反向引物XH_P7r：TGAATTGTCTCAGCGTAATC；

进一步地，扩增XH_tag10遗传位点所用引物为：

正向引物XH_P10f：TCCATATAGAGGCAGTAGAGA；

反向引物XH_P10r：TCACTATCCACCTGGCTAA；

进一步地，扩增XH_tag13遗传位点所用引物为：

正向引物XH_P13f：GCTGTTCTATGCTGTAGGA；

反向引物XH_P13r：GCACTTCTCACTCTTATTGG。

本发明目的之二，提供一种用于鉴定徐海鸡种的试剂盒，其包括以下一种或几种引物对：正向引物XH_P4f，反向引物XH_P4r；正向引物XH_P6f，反向引物XH_P6r；正向引物XH_P7f，反向引物XH_P7r；正向引物XH_P10f，反向引物XH_P10r；正向引物XH_P13f，反向引物XH_P13r；基因组DNA提取，PCR扩增所用试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括以下一种或几种引物对：扩增XH_tag1遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P1f：TCTCTTCCAGCAGGTCAG；

反向引物XH_P1r：GTCATATCCTAATAACGGTCTG；

扩增XH_tag2遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P2f：TGCTGCCTTCTCCTATCA；

反向引物XH_P2r：CCACATTGCTATCTGTATGAG；

扩增XH_tag3遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P3f：AACAACTGGATAGGTGGATAG；

反向引物XH_P3r：GCTGGCACTGACTTCAAT；

扩增XH_tag5遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P5f：CTTCACCTCCTGCCTTCT；

反向引物XH_P5r：CTCATCCAGCCTGACCTT；

扩增XH_tag8遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P8f：AGAGACAGGCTTGGAGAA；

反向引物XH_P8r：GGCAGAGAACAGACATCAA；

扩增XH_tag9遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P9f：GACATTCTCAGCACCTCAG；

反向引物XH_P9r：AAGTGTGAACCAGTGGATG；

扩增XH_tag11遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P11f：GGCAAGGAGACAGTAAGAG；

反向引物XH_P11r：GTATCGGCAGCACAGAAT；

扩增XH_tag12遗传位点所用引物对：

XH_P12f：GCTCCTTCTCTATTGACCAT；

XH_P12r：TTGAACTGCTCACATCCTC；

扩增XH_tag14遗传位点所用引物对：

XH_P14f：TTCCAACCTAAGCCATTCC；

XH_P14r：ACCGATTGAACTTCCTTGT；

扩增XH_tag15遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P15f：GAAGGAAGGAGCCATCAAT；

反向引物XH_P15r：TTCTGTAGACTGAGGTATGAC；

扩增XH_tag16遗传位点所用引物对：

正向引物XH_P16f：CATCAGCCGTCGTACTTC；

反向引物XH_P16r：GGTCACAGAGTCATAGAATCA。

本发明目的之三，提供利用以上试剂盒进行徐海鸡种鉴定的方法，包括以下步骤：

提取待测血液样品基因组DNA；

利用试剂盒中引物进行PCR扩增：

1)反应体系:10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各l0ng，5μL2×powerTaqMasterMix，剩余体积用超纯水补足；

2)反应程序:首先94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s，51.3-56.0℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min,4℃保存；

进行测序分析或毛细管电泳分析，即得。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明首次提供徐海鸡特异性位点；所述特异性遗传位点包括SNPs位点和INDELs位点；所述特异性遗传位点分布在不同染色体上，以此作为鉴定位点，提高了检测试验的准确性和柔韧性。

本发明所述徐海鸡特异性遗传位点还包括INDELs位点，选择INDELs作为特异性标记，提高了鉴定体系的稳定性，降低了检测成本。

本发明通过对徐海鸡及周边12个地方鸡种进行简化基因组测序，经过系统进化树构建、混群分析、Mantel测试、最小等位基因频率-连锁不平衡分析，筛选获得徐海鸡特异性SNPs/INDELs分子标记。然后，通过标记组合优化、PCR引物设计与验证、大群体验证，在此基础上获得徐海鸡品种特异性SNPs/INDELs标记组合。筛选所得遗传性特异位点对徐海鸡的鉴定率均在85％以上。本发明为今后徐海鸡的品种资源保护与鉴定、食品溯源提供支撑。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明一具体实施例所述基于BioNJ法构建的地方鸡种系统进化树。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1简化基因组测序筛选徐海鸡品种特异性SNPs/INDELs标记

供试样本:包括徐海鸡(20只)、济宁百日鸡(20只)、琅琊鸡(20只)、寿光鸡(20只)、汶上芦花鸡(20只)、如皋黄鸡(20只)、鹿苑鸡(20只)、狼山鸡(20只)、溧阳鸡(20只)、太湖鸡(20只)、龙胜凤鸡(20只)、闽清毛脚鸡(20只)、淮北麻鸡(20只)。翅静脉采血0.5-1.0ml，置入抗凝管，-70℃保存。

采用CTAB方法提取基因组DNA，以限制性内切酶EcoRI和NIaIII对基因组DNA进行酶切，然后加上测序接头，构建小片段文库，进行GBS简化基因组测序。

为了检查酶切的效率，便于后续序列分析，进行了染色体电子酶切评估。为了保证数据质量，对原始序列进行更严格的过滤：去除含有接头序列的读长；去除未知碱基比例大于10％的读长；去除低质量读长(Q值低于10的碱基占比高于50％以上)。龙胜凤鸡1个体因质控不合格，将其从测序数据中剔除。

为分析不同构建方法对系统进化树拓扑形状的影响，研究以地方鸡种简化基因组测序数据为对象，应用软件包IQ-tree、MrBayes构建系统进化树，所得进化树如图1所示。

以最小等位基因频率-连锁不平衡方法分析259个地方鸡简化基因组序列，筛选得到22个徐海鸡品种特异性SNPs/INDELs标记。22个遗传位点的物理位置是基于鸡全基因组参考序列比对确定的，所述鸡全基因组标准序列的版本号为(GallusgallusGRCg6)。徐海鸡品种特异性SNPs/INDELs标记具体如下：

XH_tag1位于1号染色体2096845处，EXOC4基因第14内含子，徐海鸡基因型为--(突变基因型为AGA//AGA)；

XH_tag2位于1号染色体37685187处，TRHDE基因与KCNC2基因之间，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag3位于1号染色体109648385处，DSCAM基因第3内含子，徐海鸡基因型为TT；

XH_tag4位于2号染色体62783242处，HIVEP1基因第3内含子，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag5位于2号染色体103201782处，LAMA3基因第43内含子，徐海鸡基因型为CC；

XH_tag6位于2号染色体107529257处，DTNA基因第24内含子，徐海鸡基因型为TT；

XH_tag7位于3号染色体9906477处，EHBP1第11内含子，徐海鸡基因型为TT；

XH_tag8位于3号染色体16349484处，MRPS5基因与SLC8A1基因之间，徐海鸡基因型为GG；

XH_tag9位于5号染色体37248844处，MIPOL1基因第8内含子，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag10位于5号染色体37593563处，LOC112532542基因下游，徐海鸡基因型为CC；

XH_tag11位于6号染色体16029996处，ADK基因第4内含子，徐海鸡基因型为GG；

XH_tag12位于8号染色体4589172处，NOTCH2基因第10内含子，徐海鸡基因型为AA；

XH_tag13位于9号染色体10221459处，TRIP12基因第1内含子，徐海鸡基因型为CC；

XH_tag14位于13号染色体14469791处，ADAMTS2基因第4内含子，徐海鸡基因型为GG；

XH_tag15位于13号染色体18390747处，基因KCTD16与基因SH3RF2之间，徐海鸡基因型为--(野生基因型为AA)；

XH_tag16位于18号染色体3561395处，LOC427799基因第1内含子，徐海鸡基因型为AA；

Marker1_5位于鸡1号染色体194801700处，基因ACER3第6内含子，徐海鸡基因型为GG；

Marker2_5位于2号染色体60449199处，KIF13A基因第2内含子，徐海鸡基因型为TT；

Marker4_4位于位于鸡4号染色体5445667处，基因PCDH19与DIAPH2之间，徐海鸡基因型为CC；

Marker11_3位于鸡11号染色体，物理位置6583300处，基因ADCY7的UTR5区域，徐海鸡基因型为GG；

Marker19_2位于鸡19号染色体351443处，基因MKS1第16外显子，徐海鸡基因型为GG；

MarkerZ_1位于鸡Z染色体73463410处，基因CARTPT与KCNN2之间，徐海鸡基因型为AA。

其中XH_tag1、XH_tag15为INDELs位点，其余均为SNPs位点。

实施例2徐海鸡种的鉴定方法

应用实施例1筛选所得22个标记对20份徐海鸡血样和360份非徐海鸡血样进行鉴定。具体操作步骤如下：

以CTAB法提取380份血液样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测、琼脂糖电泳检测合格后进行PCR扩增。

PCR扩增过程：

1)反应体系:10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各l0ng，5μL2×powerTaqMasterMix，剩余体积用超纯水补足。所用引物具体如下表1所示。

表1.检测徐海鸡品种特异性标记所用扩增引物

2)反应程序:首先94℃变性30s,退火30s,72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s,51.2-56.9℃退火30s,72摄氏度延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min,4℃保存。

扩增产物送至测序公司进行序列检测。对于INDELs标记，也可选择毛细管电泳检测片段扩增长度，作为基因分型结果。

表2.徐海鸡品种特异性标记鉴定率

由上述结果可知，XH_tag1-XH_tag16所述遗传特异性位点对徐海鸡的鉴定率均在85％以上，其中XH_tag7位点的鉴定率可达100％；而筛选所得Marker系列位点徐海鸡鉴定率在60％-75％之间，明显低于XH_tag1-XH_tag16所述遗传特异性位点。依据表2所示验证结果，留选鉴定率高于85％的16个标记作为徐海鸡品种特异性分子标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。