用于肝细胞癌(HCC)和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物

摘要

本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明进一步涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞和转入患者的疫苗复合体的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位。与主要组织兼容性复合体(MHC)分子结合的肽或与此同类的肽也可能是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。特别是，本发明涉及数种新型肽序列及其变体，它们源自人肿瘤细胞的HLA‑I类和HLA‑II类分子，可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中或作为开发药物/免疫活性化合物和细胞的目标。

说明书

本申请是申请日为2015年12月16日、中国申请号为201580055141.6、发明名称为″用于肝细胞癌(HCC)和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物″的分案申请。

本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞和转入患者的疫苗复合体的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位。与主要组织兼容性复合体(MHC)分子结合的肽或与此同类的肽也可能是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。特别是，本发明涉及数种新型肽序列及其变体，它们源自人肿瘤细胞的HLA-I类和HLA-II类分子，可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中或作为开发药物/免疫活性化合物和细胞的目标。

发明背景

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的肿瘤之一，占全世界所有确诊新发癌症病例的大约6％。2012年，全球大约有782,000例HCC新发病例，使之成为男性中第五位最常见癌症(554,000例)、女性中第九位常见癌症(228,000例)(http：//globocan.iarc.fr)。HCC是最常见的原发性肝恶性肿瘤，占所有成人原发性肝癌80％以上。

HCC的地域分布不同，发病率取决于性别。男性HCC年龄标准化发病率(ASR)为东亚(31.9)和东南亚(22.2)最高，南欧(9.5)和北美(9.3)中等，北欧(4.6)和中南亚(3.7)最低。女性HCC发病率比男性ASR低。女性最高ASR为东亚(10.2)和西部非洲(8.1)，最低为北欧(1.9)和密克罗尼西亚(1.6)。

HCC患者的总体预后较差。HCC的5年相对生存率(5Y-RSR)约为15％，这取决于诊断时的疾病阶段。对于癌症仍然局限于肝脏的局部HCC，5Y-RSR约为28％。对于癌症已经发展至附近或远处的器官区域和远程HCC，5Y-RSR分别为7％和2％。

HCC的发生与多种危险因素相关，肝硬化是最重要的一种危险因素。肝硬化常因酗酒或乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，但也可能由代谢疾病(如II型糖尿病)引起。因此，健康的肝组织被瘢痕组织取代，这增加了发生癌症的风险。

疾病管理取决于诊断时肿瘤的阶段以及肝脏的整体状况。如有可能，可透过手术切除部分肝脏(肝部分切除术)或整个器官(肝切除)。特别是肿瘤小或肿瘤可完全切除的患者有资格接受肝脏移植。

如果手术不是一种治疗选项，可用现有的其他疗法。肿瘤消融时，探针被注入肝脏，肿瘤被无线电或微波或冷冻治疗破坏。在栓塞程序中，肿瘤的血液供应被机械或化学方式阻断。在放射疗法中，可用高能量无线电波破坏肿瘤。

HCC的化疗包括用于全身治疗的多柔比星、5-氟尿嘧啶和顺铂的组合以及用于肝动脉输注的多柔比星、氟尿苷和丝裂霉素C。但是大多数HCC病例均于对化疗药物表现出很高的耐药性(Enguita-German and Fortes，2014)。

晚期不可切除HCC的治疗选项仅限于索拉非尼(一种多酪氨酸激酶抑制剂)(Changet al.，2007；Wilhelm et al.，2004)。索拉非尼是唯一被证实可延长生存期大约3个月的全身性药物，目前是此类患者的唯一实验性治疗方案(Chapiro et al.，2014；Llovet etal.，2008)。

最近，对于HCC进行了少量的免疫疗法试验。细胞因子已被用于启动免疫细胞的亚群和/或增加肿瘤免疫原性(Reinisch et al.，2002；Sangro et al.，2004)。其他的试验主要关注肿瘤浸润性淋巴细胞或活化外周血淋巴细胞的输注(Shi et al.，2004a；Takayamaet al.，1991；Takayama et al.，2000)。

到目前为止，已经进行了少量的治疗性疫苗接种试验。Butterfield等人使用源自甲胎蛋白(AFP)的肽或载有AFP肽的树突细胞(DC)进行了两项体外试验(Butterfield etal.，2003；Butterfield et al.，2006)。在两项不同的研究中，自体树突细胞用自体肿瘤裂解物(Lee et al.，2005)或肝母细胞瘤细胞系HepG2的裂解物(Palmer et al.，2009)进行体外冲击。到目前为止，疫苗接种试验仅显示临床结果的有限改善。

发明摘要

本发明涉及以下各项：

1.一种肽，其包括选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.300群组的一个氨基酸序列、以及与SEQ ID No.1至SEQ ID No.300具有至少88％同源性的其变体序列、其中所述变体与MHC结合和/或诱导与该变体肽发生T细胞交叉反应；以及其一种药用盐，其中所述肽不是一种全长多肽。

2.根据项1中所述的肽，其中所述肽有能力与人类主要组织兼容性复合体(MHC)-I或-II类分子结合，其中所述肽与MHC结合时能够被CD4和/或CD8 T细胞识别。

3.根据项1或2中所述的肽或其变体，其中氨基酸序列包括SEQ ID No.1至SEQ IDNo.300中的一个连续的氨基酸延伸区。

4.根据项1至3任一项中所述的肽或其变体，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸、更优选为8至16个氨基酸、最优选为该肽该肽系由或基本系由根据SEQ ID No.1至SEQ ID No.300的氨基酸序列组成。

5.根据项1至4任一项中所述的肽或其变体，其中所述肽被修饰和/或包含非肽键。

6.根据项1至5任一项所述的肽或其变体，其中所述肽为融合蛋白的一部分，尤其包含HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸。

7.根据项1至6任一项中所述的一种编码肽或其变体的核酸，任选连接到一个异源启动子序列。

8.根据项7中所述的一种能表达核酸的表达载体。

9.根据项1至6任一项中所述的肽或其变体、根据项7中所述的核酸、或根据项8中所述的药用表达载体。

10.一种宿主细胞，其包括根据项1至6中所述的肽、根据项7中所述的核酸、根据项8中所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选为抗原提成细胞，例如树突状细胞。

11.一种制备根据项1至6任一项所述的肽或其变体的方法，该方法包括培养根据项10所述的宿主细胞、其提呈根据项1至6所述的肽或表达根据项7所述的核酸或根据项8所述的表达载体，以及从该宿主细胞或其培养基中分离出肽或其变体。

12.一种体外制备启动的T淋巴细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面或人工模拟的抗原提呈细胞结构表面上表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动T细胞，其中所述抗原为项1至9任一项中所述的肽。

13.根据项12中所述的方法制成的启动T细胞，其有选择性地识别一种细胞，该细胞提呈含项1至5任一项中给定氨基酸序列的多肽。

14.一种杀灭患者中靶向细胞的方法，其中靶向细胞提呈一种多肽，该多肽含项1至5任一项中给定的氨基酸序列；一种给药方法，其中包括给予患者项13中定义的有效量T细胞。

15.一种可溶或膜结合抗体，其特异性地识别根据项1至5中的肽或其变体，优选为根据项1至5中任一项所述的、与MHC分子结合的肽或变体。或者，抗体具有进一步的效应子功能，如免疫刺激域或毒素。

16.根据项1至6任一项中所述的一种肽、根据项7中所述的核酸、根据项8中所述的一种表达载体、根据项10中所述的细胞或根据项13中所述的启动毒性T淋巴细胞或根据项15中所述的抗体和其他结合分子在治疗癌症或制造抗癌药剂中的用途。

17.根据项16所述的用途，其中所述癌症选自肝癌、脑癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌或直肠癌或白血病和其他肿瘤，其显示过度表达最优选的APOB、FASN、COPA，优选GLUL、GPAM、PLIN2、SLC16A1、SLC9A3R1、PCBD1、SEC16A、AKR1C4、ABCB11、HAL、CYP2E1、C4A、C4B、ALDH1L1、CRP、ACSL4、EEF2、HLTF、FBXO22、GALK1、TMCO1、TMEM33、ZNF318、IPO9、AMACR、C1QTNF3、CYP4F8、CYP4F3、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F2、MOCOS、A1CF、COL18A1、HPR、LBP、C19orf80、CFHR5、ITIH4、TMEM110、LARP4、LMF2、SLC10A5、SLC16A11，更优选ANKFY1、C12orf44、C16orf58、CPSF1、DCAF8、PEX19、DDX11、DDX12P、DECR2、NME4、DENND5B、DYM、EDC4、ERI3、FAM20A、FNDC3A、GPR107、GYG2、HEATR2、IFT81、KCTD3、SHKBP1、KIAA1324L、KLHL24、MARCH6、MBTPS2、MIR1279、CPSF6、NOC4L、NXF1、PANK2、PCNXL3、PIPSL、PSMD4、PSMD14、SLC35B1、TCP11L2、THNSL2、THOC2、TOMM5、TRAPPC6B、TRIM54、TRIM55、TRIM63、UGGT2、URB1、VPS54、WIZ、ZNF45、RFTN2、SCFD1、SERINC5、CCT7P2、CMAS、ANKS1A、C17orf70、CCT7、CDK5RAP2、CLPTM1，以及来自SEQ ID No.1至SEQ ID No.300肽的另一蛋白。

18.一种药盒，包括：

(a)一个容器包含一种药物组合物，其含有根据项1至6任一项所述的肽或变体、根据项7所述的核酸、根据项8所述的表达载体、根据项10所述的细胞、根据项13所述的启动T淋巴细胞或根据项15所述的溶液或冻干形式的抗体；

(b)可选的第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；

(c)可选的至少一种以上肽，选自由SEQ lD No.1至SEQ ID No.346组成的组，以及

(d)可选项，(i)使用溶液或(ii)重组和/或使用冻干粉剂型的说明书。

19.根据项18所述的套件，进一步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。

20.根据项18或19所述的套件，其中所述肽系选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.300组成的组。

21.一种用于生产个性化抗癌疫苗用于个体患者的基于化合物的和/或细胞疗法，所述方法包括：

a)识别个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；

b)将a)中确定的肽与已经接受过免疫原性预筛查和/或与正常组织相比在肿瘤中过度提呈的存储库的肽进行比较。

c)选择与患者中识别的肿瘤相关肽匹配的存储库中的至少一种肽；和

d)基于步骤c)制造个性化疫苗或基于化合物的或细胞疗法产品。

22.根据项21中所述的方法，其中所述TUMAP透过以下方法识别：

a1)将肿瘤样本的表达数据与肿瘤样本组织类型相应的正常组织样本的表达数据进行比较，以识别在肿瘤样本中过度表达或异常表达的蛋白；和

a2)将表达数据与肿瘤样本中MHCI类和/或II类分子结合的MHC配体序列相关联，以识别肿瘤过度表达或异常的蛋白质衍生的MHC配体。

23.根据项21或22所述的方法，其中MHC配体的序列的确定方法是：洗脱来自肿瘤样本分离的MHC分子结合肽，并测序洗脱配体。

24.根据项21至23任一项所述的方法，其中该类型肿瘤样本相应的正常组织样本获得自同一患者。

25.根据项21至24任一项中所述的方法，其中存储库包含的肽用基于以下步骤进行识别：

aa.透过高度并行的方法，例如微数组或基于测序的表达谱，进行全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析，其包括识别相较于正常组织在恶性组织中过度表达的基因；

ab.选择步骤aa检测到的特异性表达或过度表达的基因所编码的肽，以及

ac.透过选定的肽确定诱导体内T细胞反应，包括使用健康供体或所述患者的人类T细胞的体外免疫原性测定；或

ba.用质谱法识别来自所述肿瘤样本的HLA配体；

bb.透过高度并行的方法，例如微数组或基于测序的表达谱，进行全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析，其包括识别相较于正常组织在恶性组织中过度表达的基因；

bc.比较识别的HLA配体与所述基因表达资料；

bd.选择步骤bc检测到的特异性表达或过度表达的基因所编码的肽；

be.重新检测肿瘤组织上来自步骤bd的选定TUMAP、其在健康组织上缺乏或不经常检测，并确定在mRNA水平上过度表达的相关性；以及

bf.透过选定的肽确定诱导体内T细胞反应，包括使用健康供体或所述患者的人类T细胞的体外免疫原性测定。

26.根据项21至25任一项所述的方法，其中存储库是否包括肽免疫原性由含有体外免疫原性实验、个体HLA结合性患者免疫监测、MHC多聚体染色、ELISPOT分析和/或细胞内细胞因子染色的一种方法确定。

27.根据项21至26任一项所述的方法，其中所述存储库包括选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.346组成的组的多个肽。

28.根据项21至27任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：识别与该个体患者相应正常组织相比对所述肿瘤样本具有唯一性的至少一种突变，以及选择与突变相关并包含于疫苗或用于产生细胞疗法的一种肽。

29.根据项28中所述的方法，其中所述至少一种突变透过全基因组测序鉴定。

30.一种与HLA配体反应的可溶性或膜结合T细胞受体，其中所述配体由与选自SEQID No.1至SEQ ID No.300组成的组的氨基酸序列至少75％同源性。

31.根据项30所述的T细胞受体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID No.1至SEQ IDNo.300至少88％同源。

32.根据项30或31所述的T细胞受体，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID No.1至SEQID No.300中的任何一个。

33.根据项30至32中任何一项所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体作为可溶性分子提供并任选具有进一步的效应子功能，如免疫刺激域或毒素。

34.根据项30至33任一项中所述的一种编码TCR的核酸，任选连接到一个异源启动子序列。

35.根据项34中所述的一种能表达核酸的表达载体。

36.一种宿主细胞，其包括根据项34中所述的核酸或编码根据项15中所述的一种抗体或根据项35所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选为T细胞或NK细胞。

37.根据项30至33任一项中所述的一种制备T细胞受体的方法，所述方法包括根据项36中所述的培养宿主细胞，以及从宿主细胞和/或其培养基中分离出所述T细胞受体。

38.一种药物组合物，其包括至少一种活性成分，该成分选自以下项组成的组

a)选自由SEQ ID No.1至SEQ ID No.300组成的组的一种肽；

(b)与根据a)中的肽和/或肽MHC复合体产生反应的一种T细胞受体；

c)由根据a)中所述的肽以及HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的第1至80N-端氨基酸组成的融合蛋白；

d)编码a)至c)任一项的一种核酸或一种包含所述核酸的表达载体。

e)包括d中表达载体的宿主细胞，

f)一种启动的T淋巴细胞，透过一种方法获得，该方法包括将T细胞与a)中所述肽进行体外连接，该肽在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动所述T细胞；以及将这些活化的T细胞转入自体或其他患者的方法；

g)与a)中一种肽和/或肽-MHC复合体反应的一种抗体或可溶性T细胞受体和/或提供根据a)所述的并有可能透过与免疫启动域或毒素融合而修饰的一种肽，

h)一种适体，其识别选自包含SEQ ID No.1至SEQ ID No.300的组的一种肽和/或选自包含SEQ ID No.1至SEQ ID No.300的组一种肽与MHC分子的一种复合体，

i)根据a)至h)任一项的一种共轭或标记肽或支架以及药用载体，或药用赋形剂和/或稳定剂。

39.一种适体，其特异性地识别根据项1至5中的肽或其变体，优选为根据项1至5中任一项所述的、与MHC分子结合的肽或变体。

40.根据项38所述的一种药物组合物，其包含选自SEQ ID NO 1、2、7、225、228、301、303和312的至少一种肽，优选所有的肽。

在本发明的第一方面，本发明涉及一种肽，包含选自包括SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：300的组的一个氨基酸序列、或该序列的与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300具有至少80％，优选至少90％同源(优选至少80％或至少90％相同)的一种变体序列(其中所述变体与MHC结合和/或诱导T细胞与所述肽发生交叉反应)，或其药用盐(其中所述肽不是潜在全长多肽)。

本发明进一步涉及本发明的一种肽，包含选自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300的组的一个序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300具有至少80％、优选至少88％同源性的一种变体，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸。

下表显示了根据本发明的肽、它们各自的序列ID号(SEQ ID NO)、以及这些肽的可能源(潜在)基因。表1中所有的肽与HLA-A＊02等位基因、表2中的肽与HLA-A＊24等位基因结合。表3中的肽之前在大型列表中披露，作为高通量筛查结果，错误率高，或使用算法计算出，但之前与癌症毫无关联。他们与HLA-A＊02结合。表4中的肽是可与本发明其他肽组合使用的其他肽。肽与A＊02结合或另有说明时与A＊24结合。表5中的肽还可用于诊断和/或治疗各种恶性疾病，这些疾病涉及过度表达或过度提呈各潜在多肽。

表1：本发明中的HLA-A＊02肽-S＊＝磷酸丝氨酸

表2：本发明中的HLA-A＊24肽，含序列ID号-S＊＝磷酸丝氨酸

表3：本发明中的其他肽，之前与癌症无已知的关联-S＊＝磷酸丝氨酸

表4：用于个性化癌症疗法的肽-S＊＝磷酸丝氨酸

本发明还一般涉及本发明的肽用于治疗增殖性疾病，例如，胰腺癌、结肠癌或直肠癌、肾癌、脑癌和/或白血病。

特别优选的是本发明的肽(单独或组合)，其选自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300的组。更优选的是所述肽(单独或组合)选自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：124的组(见表1)优选为与A＊02结合，以及选自包括SEQ ID NO：187至SEQ ID NO：218的组(见表2)优选为与A＊24结合，并且其用于HCC、脑癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌或直肠癌或白血病的免疫治疗，优选为HCC的免疫治疗。

如示下面的表5A和5B所示，其中本发明的许多肽还可用于其他适应症的免疫治疗。该表显示，对于其他肿瘤类型的选定肽，发现它们过量提呈(特定提呈)于5％以上测定的肿瘤样本，或提呈于5％以上测定的肿瘤样本且几何学平均值肿瘤与正常组织的比值大于3。过度提呈定义为与最高提呈的正常样本相比，肿瘤样本中的提呈更高。经过度提呈的正常组织有：脂肪组织、肾上腺、血细胞、血管、骨髓、脑、软骨、食道、眼、胆囊、心脏、肾、大肠、肝、肺、淋巴结、神经、胰腺、甲状旁腺、腹膜、垂体、胸膜、唾液腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、甲状腺、气管、输尿管、膀胱。

表5A：本发明的肽及其在其他增殖性疾病(特别是其他癌性疾病)中的特定用途-S＊＝磷酸丝氨酸

表5B：本发明的肽及其在其他增殖性疾病(特别是其他癌性疾病)中的特定用途-S＊＝磷酸丝氨酸

NSCLC＝非小细胞肺癌，SCLC＝小细胞肺癌，RCC＝肾癌，CRC＝结肠或直肠癌，GC＝胃癌，HCC＝肝癌，PC＝胰腺癌，PrC＝前列腺癌，白血病，BRCA＝乳腺癌，MCC＝Merkel细胞癌，OC＝卵巢癌，NHL＝非霍奇金淋巴瘤，AML＝急性骨髓性白血病，CLL＝慢性淋巴细胞白血病。

因此，本发明的另一个方面涉及根据SEQ序列号1、14、15、41、43、58、59、60、81、121、135、139、144、176、236、248、275、276、283、286、288、289、290、291、300、302、304、308、313、316、317、325、326、329、331、334、342和343中任一项所述的本发明的至少一种肽与一种优选实施方案的肽联合用于治疗胰腺癌。

因此，本发明的另一个方面涉及根据SEQ序列号6、15、16、22、26、30、34、36、47、59、65、69、70、77、80、81、88、121、123、125、127、133、137、139、169、172、176、181、186、221、223、229、230、231、232、233、234、236、237、238、244、247、249、250、251、255、260、261、266、269、271、274、275、282、285、289、290、291、293、297、301、302、304、306、310、313、316、317、319、327、328、329、330、331、332、334和342中任一项所述的本发明的至少一种肽与一种优选实施方案中的肽联合用于治疗结肠癌或肾癌。

因此，本发明的另一个方面涉及根据SEQ序列号10、14、15、22、36、39、54、55、60、72、77、81、90、96、112、116、119、121、133、137、138、148、169、170、172、177、186、187、189、192、197、198、203、206、219、221、229、230、233、234、236、255、260、270、272、275、277、278、279、281、282、285、289、291、292、295、296、297、301、302、305、308、311、313、315、316、319、321、324、328、329、333、334、335、336和346中任一项所述的本发明的至少一种肽与一种优选实施方案中的肽联合用于治疗肾癌。

因此，本发明的另一个方面涉及根据SEQ序列号14、15、16、17、36、39、47、51、54、65、88、101、123、125、133、134、135、137、141、147、161、166、169、176、179、184、186、187、189、191、192、193、194、195、196、197、199、203、206、208、214、220、221、224、229、230、231、234、238、239、244、245、250、251、255、258、259、260、268、269、270、271、272、278、279、282、295、297、302、304、305、306、309、310、311、312、313、316、317、319、321、325、327、328、329、330、331、332、333、334、336、337、338、339、340、342、343、344、345和347中任一项所述的本发明的至少一种肽与一种优选实施方案中的肽联合用于治疗脑癌。

因此，本发明的另一个方面涉及根据序列ID号172、173、240、250、287、299、302、334和335中任一项所述的本发明的至少一种肽与一种优选实施方案中的肽联合用于治疗CLL。

同样，上面表5B列出的肽可以与一种优选实施方案中的肽联合形成治疗适应疾病的基础。

因此，本发明的另一个方面涉及本发明中肽的用途-优选联合用于治疗选自HCC、脑癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌或直肠癌和白血病组中的增殖性疾病；

本发明还涉及本发明的肽，其具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或以拉长形式存在的例如长度变化的-MHC-II类分子结合的能力。

本发明进一步涉及本发明中的肽，其中所述肽(每种肽)系由或基本系由根据SEQID NO 1至SEQ lD NO 300的一个氨基酸序列组成。

本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽被修饰和/或包含非肽键。

本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸融合，或与抗体(例如，树突状细胞特定抗体)或抗体的序列融合。

本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明的肽。本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。

本发明进一步涉及一种能表达和/或表达本发明核酸的表达载体。

本发明进一步涉及本发明的一种肽、本发明的一种核酸或本发明的一种表达载体，其用于治疗疾病和用于药物，特别用于治疗包括癌症和自身免疫性/炎症/免疫病理性疾病在内的疾病。

本发明进一步涉及本发明中肽或本发明中所述肽复合体(含有MHC)的抗体以及制造这些抗体的方法。

本发明进一步涉及本发明的T细胞受体(TCR)，特别是可溶性TCR(sTCR)和加工为自体或异体T细胞的克隆TCR，以及制造这些TCR的方法和载有所述TCR或所述TCR交叉反应的NK细胞的制造方法。

抗体和TCR是根据本发明的肽现有免疫治疗用途的另外实施方案。

本发明进一步涉及含本发明核酸或前述表达载体的一种宿主细胞。本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。

本发明进一步涉及配制本发明一种肽的一种方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞和从所述宿主细胞或其培养基中分离肽。

本发明进一步涉及本发明中的所述方法，其中抗原透过与足够量的含抗原提成细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原呈递细胞表面的I或II类MHC分子。

本发明进一步涉及本发明的方法，其中抗原提呈细胞由能表达含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.300、优选为含SEQ ID No.1至SEQ ID No.124、以及SEQ ID No.187至SEQ IDNo.：218所述肽的一个表达载体、或一个变体氨基酸序列组成。

本发明进一步涉及以本发明方法制备的启动T细胞，其中所述T细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞表达含一种本发明氨基酸序列的多肽。

本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明任何氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者按本发明方法制造的有效量T细胞。

本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、本发明的作为药剂或制造药剂的启动T淋巴细胞、T细胞受体或抗体或其他肽-和/或肽-MHC结合分子的用途。药剂优选为具有抗癌活性。

优选情况为，所述药剂为基于可溶性TCR或抗体的细胞治疗药物、疫苗或蛋白质。

本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中所述癌细胞为HCC、脑癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌或直肠癌或白血病，优选为HCC细胞。

本发明进一步涉及一种基于本发明肽的特定标志物蛋白和生物标志物，在此称为″靶标″，其可用于诊断和/或判断HCC的预后。本发明还涉及这些癌症治疗中新靶点的用途。

MHC分子有两类：MHC I类和MHC II类。MHC分子分别由一条α重链和β-2-微球蛋白(MHC-I类受体)或一条α和一条β链(MHC-II类受体)组成。其三位构造形成一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。大部分有核细胞上都可发现MHC-I类分子。它们提呈主要为内源性的蛋白、缺陷核糖体产物(DRIP)和较大肽裂解生成的肽。MHC II类分子主要发现于专业抗原提呈细胞(APC)上，并且主要提呈在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和MHC I类的复合体由负载相应TCR(T细胞受体)的CD8阳性T细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。因此，TCR、肽和MHC按照1∶1∶1的化学计量呈现，这一点已是共识。

CD4阳性辅助T细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重要作用。肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能引发抗肿瘤免疫反应的药物产品可能非常重要(Gnjatic S，et al.Survey of naturally occurring CD4+ Tcell responses against NY-ESO-1in cancer patients：correlation with antibodyresponses.Proc Natl Acad Sci U S A.2003Jul 22；100(15)：8862-7)。在肿瘤部位，T辅助细胞支持毒性T细胞(CTL)友好型细胞因子环境(Mortara L，et al.ClITA-induced MHCclass II expression in mammary adenocarcinoma leads to a Th1 polarization ofthe tumor microenvironment，tumor rejection，and specific antitumor memory.ClinCancer Res.2006Jun 1；12(11Pt 1)：3435-43)并吸引效应细胞，如CTL、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞(Hwang ML，et al.Cognate memory CD4+ T cells generated with dendriticcell priming influence the expansion，trafficking，and differentiation ofsecondary CD8+ T cells and enhance tumor control.J Immunol.2007Nov1；179(9)：5829-38)。

在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专业抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHC II类分子的表达(Dengjel J，et al.Unexpected abundanceof HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas.ClinCancer Res.2006Jul 15；12(14Pt 1)：4163-70)。

本发明的拉长(较长)肽可作为MHC-II类活性表位。MHC-II类表位活化的辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发TH

哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有CD8阳性T淋巴细胞，CD4阳性T细胞也能透过分泌干扰素-γ(IFNy)抑制血管生成而足以抑制肿瘤的表现。

已有CD4 T细胞作为直接抗肿瘤效应因子的证据(Braumuller et al.，2013；Tranet al.，2014)。

由于HLAII类分子的组成性表达通常仅限于免疫细胞，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽被认为是不可能的事。然而，Dengjel等人成功地在肿瘤中直接识别了多个MHC II类表位(WO 2007/028574，EP 1 760 088 B1)。

肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。

由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征由CD8+ T细胞(配体：MHC I类分子+肽表位)或CD4阳性T辅助细胞(配体：MHC II类分子)识别的肿瘤相关抗原对开发肿瘤疫苗非常重要。

对于MHC I类肽触发(引发)细胞免疫反应，它也必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(″锚″)。这样，每个MHC的等位基因都有″结合基序″，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合。

在MHC-I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们之后还必须能被T细胞负载的特异性T细胞受体(TCR)识别。

目前将肿瘤相关肽分类为以下主要几组：

a)癌-睾丸抗原：T细胞能够识别的最先确认的TAA属于这一类抗原，由于其成员表达于组织学相异的人肿瘤中、正常组织中、仅在睾丸的精母细胞/精原细胞中、偶尔在胎盘中，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLA I类和II类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员或NY-ESO-1。

b)分化抗原：肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA，大多数TAA发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛用于癌症的免疫治疗。例子包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA。

c)过度表达的TAA：在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于T细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过度表达能够透过打破先前确立的耐受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型例子为Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。

d)肿瘤特异性抗原：这些独特的TAA产生于正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可在不对正常组织带来自体免疫反应风险的情况下诱导很强的免疫反应。另一方面，这些TAA在多数情况下只与其上确认了有TAA的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤之间并不都共享TAA。在含有肿瘤特定(相关)同种型蛋白的情况下，如果肽源自肿瘤(相关)外显子也可能出现肽肿瘤特异性(或相关性)。

e)由异常翻译后修饰产生的TAA：此类TAA可能由肿瘤中既不具有特异性也不过度表达的蛋白产生，但其仍然具有肿瘤相关性(该相关性由主要对肿瘤具有活性的翻译后加工所致)。此类TAA产生于变糖基化模式的改变，导致肿瘤产生针对MUC1的新型表位或在降解过程中导致诸如蛋白拼接的事件，这可能具有也可能不具有肿瘤特异性。

f)肿瘤病毒蛋白：这些TTA是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由于它们是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发T细胞反应。这类蛋白的例子有人乳头状瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它们在宫颈癌中表达。

对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达，或表达数量相对较少。在一个优选的实施方案中，与正常健康组织相比，所述肽应在肿瘤细胞中过度提呈。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与因细胞周期控制或凋亡抑制中的其功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标(Singh-Jasuja et al.，2004)。至关重要的是，表位存在于抗原氨基酸序列中，以确保这种肽(″免疫原性肽″)来自肿瘤相关抗原，可导致体外或体内T细胞反应。

基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞反应的前提是存在具有相应TCR的T细胞，并且不存在对该特定表位的免疫耐受性。

因此，TAA是基于T细胞疗法(包括但不限于肿瘤疫苗)研发的起点。识别和表征TAA的方法基于对患者或健康受试者T细胞的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生。

然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过度表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，在本发明的一非常优选的实施例中，只选择那些针对可发现功能性和/或增殖性T细胞情况的过量提呈或选择性提呈肽，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能(″效应子T细胞″)的T细胞。

在本发明的TCR和抗体下，潜在肽的免疫原性是次要的。对于本发明的TCR和抗体，提呈是决定性因素。

针对其他癌性疾病的治疗和诊断用途在本发明肽的基础蛋白(多肽)的以下更详细描述中进行披露。

据报告，膀胱癌、横纹肌样肿瘤及卵巢癌和基因内的特定多态性的COL18A1差异表达被证明能增加散发性乳房癌的风险(Fang et al.，2013；Gadd et al.，2010；Peters etal.，2005；Lourenco et al.，2006)。

COPA基因表达和RNA编辑的变化被证明与肝细胞癌相关，实验研究显示了COPA在间皮瘤细胞中的抗凋亡作用(Sudo et al.，2010；Qi et al.，2014；Wong et al.，2003)。

CPB2活性被证明在急性早幼粒细胞白血病中显著降低(Meijers et al.，2000)。

CRP是肝脏中合成的一种急性期蛋白，被证明是多种癌症类型以及肾细胞癌和多发性骨髓瘤的预后标志物(Ljungberg，2007；Fassas and Tricot，2004)。

CRYZ是肿瘤抑制基因p53的靶基因(Bansal et al.，2011)。其编码的蛋白ζ晶体被证明可直接与抗凋亡分子bcl-2的mRNA相互作用，并稳定bcl-2在T细胞急性淋巴细胞性白血病中的过度表达(Lapucci et al.，2010)。

CSRP2的过度表达与肝细胞癌的去分化有关(Midorikawa et al.，2002)。

CYB5A编码一种解毒致癌分子的酶，是胰腺癌的一个预后因素(Blanke et al.，2014；Giovannetti et al.，2014)。

CYP27A1的表达水平增加与子宫内膜癌、乳腺癌和结直肠癌相关(Bergada etal.，2014；Nelson et al.，2013；Matusiak and Benya，2007)。

据报告，CYP2E1在大肠癌中过度表达，特定多态性与膀胱癌、肺癌和乳腺癌细胞相关(Ye et al.，2014；Patel et al.，2014；Deng et al.，2014；Leung et al.，2013)。

CYP2J2是一种酶，其被证明在多种人类癌症中过度表达，包括食道癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和结肠癌(Jiang et al.，2005；Narjoz et al.，2014)。

CYP4F8被证明在前列腺癌中高度表达(Vainio et al.，2011)。CYP4F2和CYP4F3均被证明在胰腺导管腺癌中过度表达，而只有CYP4F2在卵巢癌中过度表达(Gandhi et al.，2013；Alexanian et al.，2012)。

CYP4F11的表达被证明被NF-κB和p53调节(Kalsotra et al.，2004；Bell andStrobel，2012；Goldstein et al.，2013)。

CYPAF12的基因变异与胰腺癌患者对吉西他滨响应显著相关(Goldstein et al.，2013；Harris et al.，2014)。

一方面，高水平DAP3与胃癌对化疗更好的反应和乳腺癌更好的临床结果相关，但另一方面，据报告，DAP3在甲状腺嗜酸肿瘤和浸润性成胶质细胞瘤中过度表达(Jia etal.，2014；Wazir et al.，2012；Jacques et al.，2009；Mariani et al.，2001)。

PEX19是过氧化物酶体生物合成所必需的，但也显示可直接与p19ARF相互作用，最终导致该因子在细胞质中保留并使p53肿瘤抑制功能失活(Sugihara et al.，2001)。

DDX11属于DNA解旋酶的DEAH家族，在晚期黑素瘤中高度表达(Bhattacharya etal.，2012)。

NME4是一种核苷二磷酸激酶，在结肠癌和胃癌以及骨髓增生异常征候群中过度表达，在后者的疾病中与不良预后相关(Kracmarova et al.，2008；Seifert et al.，2005)。

DENND5B充当启动Rab-GTP酶的GDP-GTP交换因子(Yoshimura et al.，2010)。

DIEXF被证明可介导肿瘤抑制基因p53的非蛋白酶体降解(Tao et al.，2013)。

DOCK7是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，被证明在胶质母细胞瘤中过度表达并可透过启动Rac-1来增加胶质瘤细胞浸润以应对HGF(Murray et al.，2014)。

在肝细胞癌细胞株中，DRG2被证明在化疗药物诱导的细胞凋亡期间下调，而DRG2过度表达抑制在这些细胞中阿霉素诱导的细胞凋亡(Chen et al.，2012a)。

DROSHA是微小RNA生物合成中的两个关键酶之一，在许多癌症中过度表达，包括胃肠道肿瘤、乳腺癌和宫颈癌，并且似乎增强增殖、集落形成和肿瘤细胞迁移(Avery-Kiejdaet al.，2014；Havens et al.，2014；Zhou et al.，2013b)。

DUSP14基因中的SNP与黑素瘤改变风险相关(Yang et al.，2014a；Liu et al.，2013b)。

整个外显子测序研究发现胰腺内导管内乳头状黏液性肿瘤患者的DYNC1H1基因内有体细胞突变(Furukawa et al.，2011)。

EEF2蛋白被证明在肺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤和非霍奇金淋巴瘤过度表达，并在癌细胞生长中发挥致癌作用(Oji et al.，2014；Zhu etal.，2014a)。

EFR3A基因内的突变在结直肠腺瘤样本中得到鉴定(Bojjireddy et al.，2014；Zhou et al.，2013a)。

EIF2B5编码翻译起始因子B的一个亚基。该基因的单核苷酸多态性被描述与卵巢癌的存活时间相关(Goode et al.，2010)。

EIF3A(真核翻译起始因子3亚基A)在乳腺癌、肺癌、宫颈癌、食道癌、胃癌和结肠癌中过度表达，并且显示出参与细胞周期调控(Dong and Zhang，2006)。

EIF4E是在高达30％的人类恶性肿瘤(包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌)以及在许多白血病和淋巴瘤中升高的有效癌基因(Carroll and Borden，2013)。

ELOVL2被证明在肝细胞癌中过度表达(Jakobsson et al.，2006；Zekri et al.，2012)。

EPRS编码多功能氨酰tRNA合成酶，据报告，是结肠癌中肿瘤相关抗原(Line etal.，2002)。

由于DNA低甲基化，EXOSC4启动子活性在肝细胞癌增加。EXOSC4有效和特异地抑制癌细胞生长和细胞侵入能力(Drazkowska et al.，2013；Stefanska et al.，2014)。

水解酶FUCA2被发现是幽门螺杆菌粘附于人胃癌细胞所必需的(Liu et al.，2009a)。

GABRQ编码GABAA受体θ亚基。GABA被证明可透过过度表达的GABAA受体θ亚基刺激人肝细胞癌生长(Li et al.，2012)。

据报告，在鳞状细胞癌中，GALNT2过度表达可透过修改O-糖基化和EGFR的活性来增强肿瘤细胞的侵袭能力(Lin et al.，2014；Hua et al.，2012a；Wu et al.，2011)。

高水平GGH与抗叶酸细胞抗性相关联，特别是甲氨蝶呤，同时与侵袭性乳腺癌和肺内分泌肿瘤的不良预后相关(Schneider and Ryan，2006；Shubbar et al.，2013；He etal.，2004)。

GLUL在人乳腺癌细胞和星形细胞瘤中过度表达(Zhuang et al.，2011；Collinset al.，1997；Christa et al.，1994；Cadoret et al.，2002)。

据报告，GNPAT牵涉转移性黑素瘤中生长抑制和凋亡诱导(Ofman et al.，2001；Qin et al.，2013)。

据报告，GOLGA4染色体区域在宫颈癌中缺失，在骨髓增殖性肿瘤中GOLGA4与PDGFRB结构内mRNA融合(Senchenko et al.，2003；Hidalgo-Curtis et al.，2010)。

GPAM在人乳腺癌中表达，这与在细胞代谢改变和更好的整体存活相关(Brockmoller et al.，2012)。

据报告，GPT高血清水平增加胃肠癌的风险，并且与丙型肝炎病毒诱导的肝细胞癌的发生和复发有关(Kunutsor et al.，2014；Tarao et al.，1997；Tarao et al.，1999)。

GRB14已显示在乳腺癌中上调，其中高表达与更好的无病生存和总体生存相关(Huang et al.，2013；Balogh et al.，2012)。

据报告，GTF2H4中单核苷酸多态性可增加发生吸烟相关肺癌和乳头状瘤病毒诱导的宫颈癌的风险(Mydlikova et al.，2010；Buch et al.，2012；Wang et al.，2010)。

不同的研究表明，HSPA2在宫颈癌、肾细胞癌和膀胱癌的疾病进展中起着重要作用。基因内多态性与胃癌的发生有关(Singh and Suri，2014；Ferrer-Ferrer et al.，2013；Garg et al.，2010a；Garg et al.，2010b)。

HSPA8被证明在食管鳞状细胞癌中过度表达。此外，HSPA8在多发性骨髓瘤和结肠癌中过度表达，HSPA8的BCR-ABL1-诱导表达促进慢性髓性白血病细胞的存活(Dadkhah etal.，2013；Wang et al.，2013a；Chatterjee et al.，2013；Kubota et al.，2010；Jose-Eneriz et al.，2008)。

MDN1被描述为一种候选肿瘤抑制基因，在管腔B型乳腺癌中突变(Cornen et al.，2014)。

MIA3，也称为运输和高尔基组织蛋白1(TANGO)，据报导在结肠和肝细胞癌中下调，在这些实体中发挥肿瘤抑制作用(Arndt and Bosserhoff，2007)。相反，口腔鳞状细胞癌的一项研究表明，MIA3表达与肿瘤进展、转移形成和临床分期相关，指向MIA3的致癌作用(Sasahira et al.，2014)。

CPSF6被认定为″静止基因盒″中的一种基因，其与几种类型肿瘤的转移和侵袭可能的显著差异相关，如乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、食道癌、甲状腺癌(Yu et al.，2008)。

据报告，MPDZ表达水平低与乳腺癌患者预后不良相关(Martin et al.，2004)。

NAA35(也被称为MAK10)编码N(α)-乙酰转移酶35，NatC辅助亚基。在食管鳞状细胞癌患者中，检测到高度癌症富集嵌合体GOLM1-MAK10RNA，其编码一种分泌的融合蛋白，可能用作分子标志物(Zhang et al.，2013b)。

NAV2显示出特异性表达于一组结肠癌中，对含反义寡核苷酸的结肠癌细胞进行NAV2治疗诱导细胞凋亡(lshiguro et al.，2002)。

NCSTN过度表达表明雌激素受体阴性乳腺癌患者的总体生存恶化，在内分泌治疗抵抗的乳腺癌细胞中检测到高水平的Nicastrin和Notch4，它们的启动最终驱动了侵袭行为(Sarajlic et al.，2014；Lombardo et al.，2014)。

在非小细胞肺癌中NKD1蛋白降低，但NKD1 mRNA升高，前者与侵袭能力增加和预后不良相关(Zhang et al.，2011)。NKD1 mRNA也被发现在人结肠肿瘤细胞中升高(Yan etal.，2001；Zhang et al.，2011)。

据报告，在食管癌中NUDC与淋巴结转移相关，而NUDC在前列腺癌细胞中过度表达导致细胞分裂受阻(Hatakeyama et al.，2006；Lin et al.，2004)。

一项在卵巢癌中调查Notch信号传导途径作用的研究报告，与癌症相比，RFNG在腺瘤中表达频率较高(Gu et al.，2012；Hopfer et al.，2005)。

RINT1被描述为胶质母细胞瘤的一种癌基因，作为乳腺癌和Lynch征候群相关癌症中所见的一种适度渗透癌症易感基因(Ngeow and Eng，2014；Quayle et al.，2012)。

RORC的高表达被发现与乳腺癌长期无转移生存率相关。生长激素腺瘤中RORC表达下降与肿瘤大小增加以及对生长抑素治疗临床反应迟钝增加相关(Cadenas et al.，2014；Lekva et al.，2013)。

据报告，RPL17可透过抑制药物诱导的凋亡促进多药耐药(Shi et al.，2004b)。

据报告，RPS29在胃癌和结直肠癌中表达增加(Takemasa et al.，2012；Sun etal.，2005)。

SAMM50编码线粒体外膜的排序和装配机械(SAM)组分，其在β-桶状蛋白组装成线粒体外膜中发挥作用。在乳腺癌和卵巢癌细胞中以及乳腺癌、胃癌、结肠癌、肾癌和子宫癌样本中检测到生长促进嵌合体mRNA(SAMM50-PARVB)(Plebani et al.，2012)。

SERPINF2编码纤溶酶的主要抑制剂，这会降低纤维蛋白和各种其他蛋白。纤溶酶-α2-纤溶酶抑制剂复合体的血浆水平被证明是非小细胞肺癌生存的预测因子，在前列腺癌患者的血液中观察到α2-抗纤溶酶活性低(Zietek et al.，1996；Taguchi et al.，1996)。

SF3B3过度表达与雌激素受体阳性乳腺癌中整体存活和内分泌性显著相关(Gokmen-Polar et al.，2014)。

SHC1的蛋白水平在前列腺癌、转移性乳腺癌、卵巢癌和甲状腺癌和不同的异构体中升高，并且被认为作为主连接蛋白在非基因组水平介导类固醇类的有丝分裂信号(Alamet al.，2009；Rajendran et al.，2010)。

AMACR用作前列腺癌的生物标志物，因为它在该实体中高度过表达(Wu et al.，2014)。此外，还用作肾细胞癌诊断的免疫标志物(Ross et al.，2012)。

实验数据表明，C1QTNF3表达可能在骨肉瘤肿瘤生长中发挥作用，与ERK1/2信号途径活化相关，并且它是一种新型的抗凋亡脂肪因子，可透过PI3K/Akt信号途径保护充质干细胞不会发生低氧/血清剥夺诱导的凋亡(Hou et al.，2014；Akiyama et al.，2009)。

大多数肝细胞癌表达GPC3。靶向作用于GPC3的两种HCC治疗方法目前正在II期临床试验中进行测试：人源化GPC3单克隆抗体，以及包括两个GPC3衍生肽的疫苗。后一项研究中使用的肽与本文件中提出的肽不同。在所有卵黄囊肿瘤、一些肺鳞状细胞癌和卵巢透明细胞癌中也发现有GPC3表达(Filmus and Capurro，2013；Kandil and Cooper，2009)。

MAGEB2被归类为癌症睾丸抗原，因为它在睾丸和胎盘、很大一部分各种组织学类型肿瘤以及其他多发性骨髓瘤和头颈部鳞状细胞癌中表达(Pattani et al.，2012；van etal.，2011)。

MAPKAPK5编码丝氨酸/苏氨酸激酶家族的肿瘤抑制物和成员。MAPKAPK5被证明在结直肠癌中低表达，导致myc癌蛋白活性增加并透过抑制造血癌症小鼠模型中致癌ras基因活性而减少癌症形成(Yoshizuka et al.，2012；Kress et al.，2011)。

USP14过度表达与卵巢上皮癌、非小细胞肺癌和结直肠癌中的肿瘤细胞增殖增加和较差预后有关(Wang et al.，2015；Wu et al.，2013a；Shinji et al.，2006)。

C4A被描述为多囊卵巢综合症和子宫内膜癌的生物标志物，实验数据表明，C4可介导癌症生长(Galazis et al.，2013；Rutkowski et al.，2010)。

据报告，CAPZB在人乳头瘤病毒18阳性口腔鳞状细胞癌中过度表达，被确定为前列腺癌易感基因(Lo et al.，2007；Nwosu et al.，2001)。

CFHR5基因内的单核苷酸多态性与滤泡性淋巴瘤的无事件生存率相关(Charbonneau et al.，2012)。

CLIP1编码含有连接蛋白1的CAP-GLY结构域，其把内吞囊泡连接至微管。此基因在霍奇金病和里德-斯特恩伯格细胞和乳腺癌中高表达，并似乎涉及乳腺癌和胰腺癌细胞的迁移和侵袭(Sun et al.，2013；Suzuki and Takahashi，2008；Liet al.，2014a；Sun etal.，2012)。

CLU可抑制肿瘤进展，而在晚期瘤变中，其可透过抑制许多治疗性应激物和提高转移而带来肿瘤的显著生存优势。CLU已经显示出在前列腺癌发病机制中的关键作用，透过调节ERK1/2信号和MMP-9表达来调节人肾透明细胞癌细胞的侵袭行为，并形成晚期肺癌治疗的抗性(Trougakos，2013；Panico et al.，2009；Takeuchi et al.，2014；Wang et al.，2014)。

融合基因SEC16A-NOTCH1报告为乳腺癌的第一复发融合基因(Edwards andHowarth，2012)。

在SHQ1基因的复发性缺失已在前列腺癌和宫颈癌中观察到，提示SHQ1具有肿瘤抑制作用(Krohn et al.，2013；Lando et al.，2013)。

在透明细胞肾细胞癌和膀胱癌中，SLC16A1高表达与预后不良因素相关，并可预测肿瘤的进展。在结直肠癌中，SLC16A1基因的单核苷酸多态性可影响临床结果，并且可用来预测对辅助化疗的反应(Kim et al.，2015；Fei et al.，2014a；Fei et al.，2014a)。

成胶质细胞瘤已经显示可释放高水平的谷氨酸，这可能会刺激肿瘤细胞增殖、促进肿瘤侵袭性，并下调SLC1A2，这与较高的肿瘤分级相关，提示其在神经胶质肿瘤进展中发挥潜在作用。此外，在胃癌中已检测到SLC1A2与CD44的融合基因，并且该基因可能代表了一类基因融合，其建立了一个有利于肿瘤生长和存活的亲致癌代谢环境(Tao et al.，2011；de Groot et al.，2005)。

SLC3A2较高表达与胆道癌患者的肿瘤生长、生物攻击性和生存相关，并且透过PI3K/Akt途径促进细胞增殖显著导致非小细胞肺癌患者的较差预后。此外，SLC3A2与整合素β1、整合素β3和Fak过度表达与结直肠癌的进展和肝转移相关(Kaira et al.，2014；Feiet al.，2014b；Sun et al.，2014)。

SLC9A3R1参与癌症进展的证据存在于肝细胞癌、神经鞘瘤、成胶质细胞瘤、结直肠癌中，尤其在乳腺癌中(Saponaro et al.，2014)。

NFYC已经被报告可促进胃癌和前列腺癌细胞中癌基因的表达(Zhang et al.，2014a；Gong et al.，2013)。

THY1是鼻咽癌抗侵袭活性的候选抑癌基因(Lung et al.，2010)。

TIMM17A在21T乳腺癌细胞中过度表达，乳腺癌组织中的mRNA表达与肿瘤进展相关(Xu et al.，2010)。

TMEM209在肺癌中广泛表达(Fujitomo et al.，2012)。

TNK2又称ACK1酪氨酸激酶，在多种人类癌症中被启动、扩增或突变。去调节激酶具有致癌性，它的启动与进展为转移期相关。ACK1抑制剂在临床前研究中显示出良好前景(Mahajan and Mahajan，2013)。

TRIM55编码RING锌指蛋白，其在肌肉肌节组装过程中与微管、肌球蛋白和肌联蛋白瞬时相关，并且还参与肌节到细胞核信号传导(Pizon et al.，2002)。

Ufd1蛋白的RNA干扰可以使羟基耐结肠癌细胞株SW1116/HCPT对羟基喜树碱敏感(Chen et al.，2011a；Chen et al.，2011c)。

在结直肠癌中，UGT1A1基因透过甲基化沉寂，因此被认为是伊立替康(CPT-11)药物抗性和药物抗性逆转控制机制的研究目标靶点(Xie et al.，2014)。

UGT1A10是在胃癌和胆道组织中表达(Strassburg et al.，1997)，其过度表达显著增加了抗肿瘤剂5-二甲基氨基丙基氨基-8-羟基三唑吖啶C-1305的细胞毒性(Pawlowskaet al.，2013)。此外，UGT1A10催化外源性化学物质、诱变剂和活性代谢物的葡糖醛酸结合，从而作为间接的抗氧化剂。在UGT1A8、UGT1A9及UGT1A10的启动子中进行检测到生物外源性(XRE)和抗氧化剂(ARE)反应元素(Kalthoff et al.，2010)。

UGT1A8主要在胃肠道中表达(Gregory et al.，2003)，经化疗预防剂莱菔硫烷(SFN)治疗后mRNA表达上调(Wang et al.，2012)。

UGT1A7单倍型与乙肝病毒携带者的肝细胞癌风险增加有关(Kong et al.，2008)。

UGT1A6在对甲氨蝶呤抗药的乳腺癌细胞中过度表达(de Almagro et al.，2011)并由一种假定的化疗预防剂β-萘黄酮诱导(Hanioka et al.，2012)。

UGT1A9主要在肝和肾中表达(Gregory et al.，2003)。UGT1A9生殖多态性是前列腺切除术后前列腺癌复发的潜在预测因素(Laverdiere et al.，2014)。

UGT1A4启动子和编码区的多态性导致阿那曲唑(乳腺癌患者的一种芳香酶抑制剂)的葡糖醛酸化的变化(Edavana et al.，2013)。

UPF1是无义介导mRNA降解(NMD)机制的一部分，并且可能在前列腺癌进展和转移中发挥着功能性作用(Yang et al.，2013)。另外，UPF1 RNA监控基因在胰腺癌腺鳞癌中通常突变(Liu et al.，2014)。

UQCRB是线粒体复合体III的一个亚基。肿瘤细胞中UQCRB的抑制阻止缺氧诱导的肿瘤血管生成(Jung et al.，2013)。UQCRB的3′非翻译区的两个SNP作为结直肠癌的候选预后标志物(Lascorz et al.，2012)。

与结节性黑素瘤相比，USO1的拷贝数变化与浅表扩散性黑素瘤差异基因表达相关(Rose et al.，2011)。

在人结肠癌中检测到USP10和SIRT6蛋白表达显著减少(Lin et al.，2013)。

UTP18也改变翻译以促进抗逆性和生长，并经常在癌症中获得并过度表达(Yanget al.，2014b)。

VARS rs2074511多态性与三阴性型乳腺癌患者的存活相关，因此可被认为是早期乳腺癌患者存活的预后因子(Chae et al.，2011)。

VMP1是一种应激诱发的自噬相关蛋白，也被癌基因KRAS诱发(Lo Re et al.，2012)。VMP1在低分化人胰腺癌中过度表达，对化疗药物产生反应(Gilabert et al.，2013)。VMP1在人HCC组织中被发现显著下调，并与多个肿瘤结节、无包膜形成、静脉侵犯和HCC预后不良密切相关(Guo et al.，2012)。

WDR26保护心肌细胞免受氧化应激的影响(Feng et al.，2012)。

ZC3H7A是称为巨噬细胞活化的调节因子CCCH锌指蛋白家族的一部分(Liang etal.，2008)。ZC3H7A被发现在胰腺导管腺癌转移性肿瘤中有更高的功能突变等位基因频率(Zhou et al.，2012)。

FASN是一种脂肪酸合酶，参与不同类型癌症(包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌和子宫内膜癌)的增强脂质合成(Wu et al.，2014；Zhao et al.，2013)。

FGG在肝细胞癌以及前列腺癌、肺癌和乳腺癌中上调(Vejda et al.，2002；Zhu etal.，2009)。

FMO5是一种单加氧酶，是占主导地位的肝特异性FMO，并且在雌激素受体α阳性乳腺肿瘤中上调(Bieche et al.，2004；Zhang and Cashman，2006)。

HADHA mRNA随着HCC(Tanaka et al.，2013)和雌激素受体α阴性乳腺肿瘤(Mamtani and Kulkarni，2012)去分化的进展而下降。

HAL基因的遗传变异可能在皮肤癌发生中起作用(Welsh et al.，2008)。

HLTF是具有解旋酶和E3泛素连接酶活性的转录调节因子SWI/SNF家族中的一员，被发现透过结肠、胃、子宫、膀胱和肺肿瘤的超甲基化而失活(Debauve et al.，2008；Castro et al.，2010；Garcia-Baquero et al.，2014)。

HDAC10是一种组蛋白脱乙酰和转录调节因子。与相邻组织相比，HDAC10的表达在胃癌组织中显著降低(Jin et al.，2014)。HDAC10在宫颈鳞状细胞癌人类患者中与淋巴结转移负相关(Song et al.，2013)。HDAC10在恶性肾上腺皮质肿瘤中超甲基化(Fonseca etal.，2012)。HDAC10水平在慢性淋巴细胞性白血病中增加(Wang et al.，2011)。HDAC10-589C＞T启动子多态性与慢性HBV患者的肝癌发生以及慢性HBV患者的HCC加重显著相关(Park et al.，2007)。II类组蛋白脱乙酰基因的表达降低与肺癌患者的不良预后有关(Osada et al.，2004)。

HIP1R表达低与弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的较差预后密切相关(Wong et al.，2014)。

HM13是一种信号肽肽酶，影响结直肠腺瘤中的细胞活力(Sillars-Hardebol etal.，2012)。

恶性淋巴瘤患者的血清HPR水平比未患病的对照组明显更高，HPR表达随着疾病进展而增加(Epelbaum et al.，1998)。HPR表达平行于乳腺癌恶性可能增加，HPR-阳性乳腺癌更有可能在首次切除后复发并与较短的无病间隔相关(Shurbaji et al.，1991)。

HSD11B1基因中的变体(rs932335)与结肠直肠癌和乳腺癌有关(Feigelson etal.，2008；Wang et al.，2013b)。

接受雄激素剥夺治疗(ADT)的前列腺癌患者组织中HSD17B6表达明显高于未治疗患者的组织中表达(lshizaki et al.，2013)。

HSPE1是一种线粒体伴侣蛋白，在蛋白质折迭和细胞信号传导(NF-KB和WNT信号传导)中发挥作用。HSP10水平升高发现于大肠癌、宫颈外口癌、前列腺癌、套细胞淋巴瘤和浆液性卵巢癌的肿瘤细胞中。在支气管癌中，报告Hsp10水平下降(David et al.，2013)。

移植到裸鼠侧腹并用紫杉醇治疗的卵巢癌异种移植物与未治疗的异种移植物相比，表现出IDI1表达下降t(Bani et al.，2004)。

IGFBPL1是胰岛素生长因子的调节因子，因异常超甲基化在乳腺癌细胞系下调。IGFBPL1甲基化与较差的总生存率和无病生存率明显相关(Smith et al.，2007)。

雄激素敏感微粒相关蛋白IKBKAP调制前列腺上皮和神经元标志物的表达，透过雄激素受体依赖性机制减低增殖，并在LNCaP前列腺腺癌细胞中共同调节雄激素受体介导的转录(Martinez et al.，2011)。

INTS8是标志物组的一部分，将胃癌与邻近非癌性组织区分开来(Cheng et al.，2013)。

IRS2衍生肽pIRS-21097-1105在HLA-A2(+)黑色素瘤和乳腺癌、卵巢癌和结直肠癌中提呈(Zarling et al.，2014)。IRS-2 1057 DD基因型和D等位基因与HCC风险显著相关(Rashad et al.，2014)。

ITGA7是层粘连蛋白-1受体二聚体整合素α-7/β-1的α链。ITGA7是一种肿瘤抑制基因，对抑制恶性肿瘤的生长至关重要。突变分析表明，前列腺癌、肝细胞癌、软组织肉瘤以及胶质母细胞瘤中存在ITGA7突变。ITGA7在非转移性前列腺癌和子宫平滑肌肉瘤中下调(Tanet al.，2013)。

ITIH4在几种肿瘤组织包括结肠、胃、卵巢、肺、肾、直肠和前列腺肿瘤中下调(Hammet al.，2008)。ITIH4低血清水平与HCV相关HCC患者的较短生存期相关(Noh et al.，2014)。ITIH4血清浓度在乳腺癌中观察到显著降低，手术后ITIH4血清水平显著降低(van，let al.，2010)。

错义突变在SHKBP1中发现，其作用于FLT3的下游，FLT3在大约30％的AML病例中(一种受体酪氨酸激酶)突变(Greif et al.，2011)。SHKBP1是在疾病不同阶段对分化良好的小肠神经内分泌肿瘤(WD-SI-NET)进行分类的几个候选潜在蛋白质生物标志物之一(Darmanis et al.，2013)。

与对应的非肿瘤组织相比，KLB表达在HCC组织中升高(Poh et al.，2012)。

LBP多态性rs2232596与中国汉族结直肠癌风险显著增加相关(Chen et al.，2011b)。LBP是卵巢癌中的一种候选血清生物标志物(Boylan et al.，2010)。在小细胞肺癌患者中，LBP在化疗治疗后显著降低(Staal-van den Brekel AJ et al.，1997)。

LBR mRNA表达与乳腺癌的肿瘤分级和诺丁汉预后指数直接相关(Wazir et al.，2013)。LBR在乳头状甲状腺癌细胞中大量表达，但该蛋白的异常折迭可解释其缺乏免疫反应性并与核膜反常折迭有关(Recupero et al.，2010)。

LEPR失调已在多种恶性细胞(包括结肠癌、肝癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、乳腺癌和肺癌)中进行了报告(Ntikoudi et al.，2014；Surmacz，2013；Uddin et al.，2011)。

LIG1单核苷酸多态性与肺癌、子宫内膜癌和神经胶质瘤的风险相关(Doherty etal.，2011；Lee et al.，2008；Liu et al.，2009b)。

LRPPRC在胃癌组织中的表达比相应对照组织中显著较高(Li et al.，2014b)。LRPPRC水平作为前列腺腺癌(PCA)患者的预后标志物，LRPPRC水平高的患者手术后的生存时间短于LRPPRC水平低的患者(Jiang et al.，2014)。LRPPRC在各种肿瘤，如肺腺癌、食道鳞状细胞癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、子宫内膜腺癌和淋巴瘤中大量表达(Tian et al.，2012)。

MANEA在前列腺癌细胞中的表达受雄激素调节(Romanuik et al.，2009)。

OPLAH在肺、乳腺、肾、结肠和卵巢正常和肿瘤组织中表达，OPLAH在正常标本中的水平比肿瘤患者中明显较高(Srivenugopal and Ali-Osman，1997)。

ORM2糖型为区别原发性和继发性肝癌提供了有价值的信息(Mackiewicz andMackiewicz，1995)。与对照组相比，ORM2血浆水平被证实在结直肠癌患者中显著升高(Zhang et al.，2012)。与对照组相比，岩藻糖形ORM2水平在腺癌肺癌病例中显著较高(Ahnet al.，2014)。ORM2用于胆管癌早期诊断的一种推定生物标志物(Rucksaken et al.，2012)。

四氢生物蝶呤水平升高导致人肝癌细胞中的PAH活性和PAH蛋白质增强(McGuire，1991)。

PARP14在骨髓瘤浆细胞高表达，与疾病进展和不良生存期相关。PARP14与JNK2依赖型生存期极度相关。PARP14被发现可透过结合和抑制JNK1促进骨髓瘤细胞的存活(Barbarulo et al.，2013)。

PC水平在肝肿瘤和肺癌中升高(Chang and Morris，1973；Fan et al.，2009)。

PCNT水平升高和中心体异常已在各种恶性血液病和实体瘤(包括AML、CML、套细胞淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌)中进行了说明(Delaval and Doxsey，2010)。

PIGN是一种癌症染色体不稳定(CIN)-抑制基因，在CIN(+)结直肠癌中发生频繁的拷贝数损失(Burrell et al.，2013)。

PIPOX表达根据乳腺癌亚型变化，HER-2型肿瘤显示表达升高，三阴性乳腺癌亚型显示表达下降。肿瘤PIPOX消极性与较短的无病生存期相关(Yoon et al.，2014)。PIPOX在前列腺肿瘤中下降，并透过代谢肌氨酸降低前列腺细胞的致癌潜力(Khan et al.，2013)。

在结肠癌、骨髓瘤和肝细胞癌中检测到PSMD4水平升高(Arlt et al.，2009；Midorikawa et al.，2002；Shaughnessy，Jr.et al.，2011)。

与对照组相比，PLIN2在透明细胞和乳头状肾细胞癌患者中显著升高。PLIN2术前尿浓度反映肿瘤大小和分期(Morrissey et al.，2014)。PLIN2在肺腺癌标本中的表达显著高于正常组织和肺鳞状细胞癌(Zhang et al.，2014b)。

PLK4在人癌症中经常发生重排或损失，在肝细胞癌中发生率特别高，同时也在结直肠癌、头颈部癌中发生(Swallow et al.，2005)。PLK4在乳腺癌中过度表达(Marina andSaavedra，2014)。

QARS是氨酰基-tRNA合成酶(ARS)的一员，以谷氨酰胺装载tRNA。ARS表达和多态性与乳腺癌和成胶质细胞瘤相关(He et al.，2014b；Kim et al.，2012)。

甲基化PMF1基因是膀胱癌患者的诊断和预后生物标志物(Kandimalla et al.，2013)。

几种人类肿瘤和血液恶性肿瘤上调PON2，包括甲状腺、前列腺、胰腺、睾丸、子宫内膜/子宫、肝、肾、淋巴组织、膀胱肿瘤、ALL和CML，这种过度表达对不同化疗药物(伊马替尼、多柔比星、星形孢菌素或放线菌素)产生耐药性(Witte et al.，2011)。

PRKAR2A是蛋白激酶A的一种调节亚基。PRKAR2A显著增加接受紫杉醇和泰索帝治疗的前列腺癌细胞系的生存期(Zynda et al.，2014)。PRKAR2A在肺腺癌中过度表达(Bidkhori et al.，2013)。

PRPF6是tri-snRNP(小核糖核蛋白)剪接复合体的一员，其透过生长调节相关基因的优先剪接驱动结肠癌增殖(Adler et al.，2014)。PRPF6在肺腺癌中过度表达(Bidkhoriet al.，2013)。

与相应的邻近正常前列腺组织相比，PSMC4在前列腺癌细胞中显著和相干上调(Hellwinkel et al.，2011)。

QPRT表达随着脑胶质瘤的恶性程度增加，并在放化疗后复发性胶质母细胞瘤中表达增加，QPRT表达与较差预后相关(Sahm et al.，2013)。QPRT是滤泡甲状腺结节免疫组织化学筛查的潜在标志物(Hinsch et al.，2009)。

RABGGTB在化疗难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤中过度表达(Linderoth et al.，2008)。

RAD21在胃肠道肿瘤、结肠直肠癌、晚期子宫内膜癌、前列腺癌和乳腺癌中过度表达(Atienza et al.，2005；Deb et al.，2014；Porkka et al.，2004；Supernat et al.，2012；Xu et al.，2014)。

RAD23B在乳腺癌进展中发挥着潜在作用(Linge et al.，2014)。单核苷酸多态性RAD23B rs1805329与日本HCV患者的HCC发生和复发有关(Tomoda et al.，2012)。

RASAL2是一种RAS-GTP酶-活化蛋白，在雌激素受体阳性乳腺癌、卵巢癌和肺癌中具有肿瘤抑制功能(Li and Li，2014；Huang et al.，2014)。与此相反，RASAL2在三阴乳腺癌中具有致癌性，并促进间质浸润和转移(Feng et al.，2014a)。

RNMT耗竭在不同类型癌症(包括肝癌)中有效和特异地抑制癌细胞生长和癌症细胞浸润能力(Stefanska et al.，2014)。

导致激酶活性升高的ROCK1过度表达或ROCK1基因突变已经在数种癌症(包括肺癌、胃癌、CML和AML)中报告(Rath and Olson，2012)。

RPL10A是c-Myc靶基因，可能有助于肝细胞转化(Hunecke et al.，2012)。

与骨髓性白血病或骨髓增生异常预后特别差相关的INV(3)和t(3；3)断点在位于RPN1基因着丝粒和下游的区域簇生(Wieser，2002)。

RRBP1在肺癌和乳腺癌中过度表达(Telikicherla et al.，2012；Tsai et al.，2013)。

SCFD1表达在糜烂性胃炎中增加，这与胃癌相关(Galamb et al.，2008)。

ABCB1编码在各种器官(如肠、肝、肾、脑和胎盘)正常细胞中表达的P-糖蛋白(P-gp)。P-gp过度表达和基因多态性在结直肠癌以及肾上腺肿瘤、肺癌和ALL中检测到(Zhanget al.，2013a；Fojo et al.，1987；Gervasini et al.，2006；Jamroziak et al.，2004)。

ABCB10编码亚家族B的ABC转运蛋白(MDR/TAP)。ABCB10被证明参与KCP-4人表皮样癌细胞的顺铂抗性(Oiso et al.，2014)。

ABCB11的表达被证明在胰腺导管腺癌(最耐药的癌症之一)中上调。因此，这可能归因于这种癌症的普遍较差的治疗反应(Mohelnikova-Duchonova et al.，2013)。

ABCC2在原发性输卵管癌中的上调表达与较差预后相关(Halon et al.，2013)。

ABCC6在对姑息化疗无应答的结直肠癌中明显下调(Hlavata et al.，2012)。相反，在耐吉西他滨的人NSCLC A549细胞中上调(Ikeda et al.，2011)。

ACACA的表达被证明在许多人类癌症(如乳腺癌、前列腺癌和肝癌)中上调，与癌细胞脂肪生成增强有关。各种ACACA抑制剂显示，透过细胞增殖的抑制对癌细胞系产生治疗作用，透过细胞凋亡诱导细胞死亡(Zu et al.，2013)。

ACLY在各种肿瘤(如乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌)中异常表达，与肿瘤分期和分化负相关(Zu et al.，2012)。

ACSL3在肺癌中过度表达，基于临床前研究，是肺癌治疗的有前景的新治疗靶标(Pei et al.，2013)。ACSL3上调表达可以作为雌激素受体特异性乳腺癌风险的潜在生物标志物(Wang et al.，2013c)。

ACSL4在雌激素受体阴性乳腺肿瘤以及在雄激素受体阴性乳腺癌和前列腺肿瘤中过度表达。类固醇激素敏感性损失与ACSL4表达的诱导有关(Monaco et al.，2010)。研究显示，ACSL4上调在从腺瘤向腺癌转换期间发生(Cao et al.，2001)。

ACSS3的甲基化发现与经典风险因素(即年龄、阶段或神经母细胞瘤MYCN状态)中的至少一种相关(Decock et al.，2012)。

ADSSL1缺失常在致癌物诱导小鼠原发性肺腺癌、小鼠和人肺腺癌细胞系中观察到，并与在原发性小鼠肺肿瘤更广泛的染色体不稳定性表型相关(Miller et al.，2009)。

AGFG2被确定为识别可能保持无转移复发的激素受体阴性或三阴性乳腺癌病例的14种候选预后基因之一(Yau et al.，2010)。

AGT是一种非常有效的抗血管生成因子，其显示可在体外和体内发挥抗肿瘤效果(Bouquet et al.，2006)。在转基因小鼠中，人AGT的过度表达显示可减少血管生成，从而推迟肝癌的进展(Vincent et al.，2009)。

AKR1C4编码人类醛-酮还原酶家族1成员C4并催化视黄醛还原为视黄醇(Ruiz etal.，2011)。因此，视黄醛耗竭下调视黄酸的生物合成，随后阻断类视黄醇信号，这有利于肿瘤进展(Tang and Gudas，2011；Ruiz et al.，2012)。

研究显示ALDH1L1的表达在HCC和脑胶质瘤中下调。ALDH1L1在上述癌症中的下调与较差的预后和更具侵袭性的表型相关(Rodriguez et al.，2008；Chen et al.，2012b)。

研究显示ALG3的表达在食管鳞状细胞癌和宫颈癌中增强(Shi et al.，2014；Choiet al.，2007)。在食管鳞状细胞癌中，ALG3表达增加与淋巴结转移有关(Shi et al.，2014)。

ANKS1A被认定为是Src家族激酶的新靶标，已知涉及某些结直肠癌的发生(Emaduddin et al.，2008)。

APOA1编码载脂蛋白A-I，该蛋白是高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白成分。在多种动物肿瘤模型中，APOA1在肿瘤发生中显示出强效的免疫调节作用，并显示可透过支持先天和适应性免疫过程以抑制肿瘤生长和转移(Zamanian-Daryoush et al.，2013)。

APOA2被证明在胰腺癌患者中被显著降低(Honda et al.，2012)。与此相反，APOA2的表达增加与HCC相关(Liu et al.，2007)。

在甲胎蛋白阴性HBV相关HCC中，APOB被发现是可能与HCC进展相关联的14个差异表达蛋白质之一(He et al.，2014a)。在晚期乳腺癌中，APOB被发现是可预测新辅助化疗反应和患者无复发生存期的6种差异表达蛋白之一(Hyung et al.，2011)。

根据III期结肠直肠癌患者以及在人黑色素瘤细胞中，AQP9与化学抗性增加有关(Dou et al.，2013；Gao et al.，2012)。

ARG1被证明是区分HCC和肝脏其他转移性肿瘤的一种敏感和特异性标志物(Sanget al.，2013)。ARG1可能有助于NSCLC的局部免疫抑制(Rotondo et al.，2009)。

与健康供体相比，磷酸化以及活性更高形式的ARSB蛋白被发现在慢性髓性白血病患者外周血白细胞中增加(Uehara et al.，1983)。

在卵巢癌细胞中，ASNA1的下调被证明可对化疗药物顺铂、卡铂、奥沙利铂和亚砷酸盐的敏感度(Hemmingsson et al.，2009)。

研究显示，ASPH在各种癌症和癌细胞系中过度表达(Yang et al.，2010)。用ASPH装载的树突状细胞接种产生对抗体外胆管癌细胞的细胞毒性，并显著抑制肝内肿瘤生长和转移(Noda et al.，2012)。

ATP1A2被发现是在胶质母细胞瘤中显著上调的31个蛋白之一(Com et al.，2012)。与此相反，ATP1A2在骨髓浸润转移性成神经细胞瘤中下调(Morandi et al.，2012)。

ATP1A3被发现是在胶质母细胞瘤中显著上调的31个蛋白之一(Com et al.，2012)。

ATP6V1C1可透过溶酶体V-ATP酶活性的调控来促进乳腺癌生长和骨转移。ATP6V1C1下降明显抑制小鼠4T1乳腺肿瘤细胞异种移植物肿瘤的生长、转移以及体内溶骨性病变(Feng et al.，2013)。ATP6V1C1被证明在口腔鳞状细胞癌中过度表达，并与肿瘤细胞的活动性有关(Otero-Rey et al.，2008)。

ATP7B与抗顺铂(广泛使用的抗癌药物)的癌症有关(Dmitriev，2011)。

AXIN2编码Axin-(轴抑制)相关蛋白2，其可能在Wnt信号通路中对β-连环蛋白的稳定性调节中起着重要作用(Salahshor and Woodgett，2005)。此外，AXIN2被证明压制癌基因c-MYC的表达(Rennoll et al.，2014)。

在HCC中，与BAAT较高表达的患者相比，BAAT低表达与较差的生存期相关(Furutani et al.，1996)。

与正常肝组织相比，BHMT和BHMT2转录物显示在HepG2细胞和HCC样本中急剧下降(Pellanda et al.，2012)。

C12orf44被证明是对自噬是必要的，并以Atg13依赖的方式与ULK1相互作用(Mercer et al.，2009)。自噬在癌症中有双重角色，透过防止损伤蛋白质和细胞器累积充当肿瘤抑制物，充当能促进已确定肿瘤的生长的细胞存活机制(Yang et al.，2011b)。

C17orf70是范可尼贫血核心复合体成分，对于复合体的稳定性是必不可少的。范可尼贫血核心复合体在DNA损伤应答网络中发挥着中心作用。范可尼贫血核心复合体介导的DNA损伤反应涉及乳腺癌易感基因产物BRCA1和BRCA2(Ling et al.，2007)。

C19orf80编码肝细胞癌相关基因TD26，并被证明是HCC中甲基化水平最高在对照组织中最低的5个位点之一(Ammerpohl et al.，2012)。

CCT7被发现是一种蛋白质子网的一部分，该网络可明显判别晚期人结直肠癌(Nibbe et al.，2009)。

CDK6已显示可调节肿瘤抑制Rb蛋白的活性。CDK6可透过增强细胞增殖和刺激血管生成发挥其肿瘤促进功能(Kollmann et al.，2013)。CDK6的药理抑制显示可抑制异常白血病细胞的生长分化(Placke et al.，2014)。

CFH可能在皮肤鳞状细胞癌的进展中起着一定的作用(Riihila et al.，2014)。CFH可能在各种癌细胞中补体介导的裂解抗性起着关键作用，并显示出在NSCLC中过度表达，这与预后较差有关(Cui et al.，2011)。

CLPTM1的失活突变在前列腺癌细胞中被发现(Rossi et al.，2005)。

CMAS编码胞苷酸N-乙酰神经氨酸合成酶，其催化唾液酸的活化以及其转化为单磷酸胞苷二酯。活化的唾液酸用于N-糖基化，这是细胞分化过程中一种常见的翻译后修饰。癌细胞表面上唾液酸糖表达增加是已知的肿瘤特征之一(Bull et al.，2014)。

TF(转铁球蛋白)是使用最广泛的肿瘤靶向配体之一，因为TF受体(TFR)在恶性细胞上过度表达，并透过与TF相互作用在细胞铁摄取中起着关键作用(Biswas et al.，2013)。TFR的表达水平已表明与肿瘤分期或癌症进展相关(Tortorella and Karagiannis，2014)。

TH1L可能在人乳腺癌细胞增殖和侵袭的调节中起着重要作用，并且可能是人乳腺癌治疗的潜在靶点(Zou et al.，2010)。

THTPA水解可能负责NDRG-1的抗增殖作用。NDRG-1已经显示可减少乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌的侵袭和转移(Kovacevic et al.，2008)。

SMYD3透过金属蛋白酶MMP-9的表观遗传上调而促进癌浸润(Medjkane et al.，2012)。SMYD3的表达在许多类型的人正常组织中检测不到或非常弱，而SMYD3的过度表达与胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、前列腺癌和乳腺癌的发生和发展相关(Hamamoto et al.，2006；Liu et al.，2014；Liu et al.，2013a)。

在大脑中缺乏STAT2(Yue et al.，2015)或组成性表达IFN-α(Wang et al.，2003)的转基因小鼠中观察到了STAT2与肿瘤发生之间的联系。

TACC3在许多人类癌症(包括卵巢癌、乳腺癌、鳞状细胞癌和淋巴瘤)中过度表达(Ma et al.，2003；Jacquemier et al.，2005；Lauffart et al.，2005)。

SPBP还显示可压制雌激素受体α(ERα)的转录活性。SPBP过度表达抑制Erα依赖性乳腺癌细胞系的增殖(Gburcik et al.，2005)。在细胞核中，SPBP显示相对低的活动性，并富集在染色质密集区域，这清楚地表明它是一种染色质结合蛋白(Darvekar et al.，2012)。TCF20对于对抗氧化应激的细胞防御方案中涉及的蛋白质增强诱导很重要(Darvekar et al.，2014)。

C3是炎性肿瘤微环境的一种突出元素(Rutkowski et al.，2010)，活化可带来一种肿瘤生长优势(Markiewski et al.，2008)。C3的酶裂解导致产生过敏毒素C3a(炎症介质和化学引诱物)和C3b(Sahu et al.，1998)。

CLN3是NT2神经元前体细胞和一些类型癌症的抗凋亡基因(Zhu et al.，2014b)。它参与神经元和非神经元细胞内的细胞内运输和调节(Rakheja et al.，2008；Getty andPearce，2011)，它牵涉几个重要的信号通路(Persaud-Sawin et al.，2002)。在许多癌症细胞系(包括乳腺癌、结肠癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤以及胶质母细胞瘤，但不包括肺癌或胰腺癌细胞系)中CLN3 mRNA和蛋白过度表达(Rylova et al.，2002)。

SLC13A5是7个CIMP-标记基因之一。肾透明细胞癌(ccRCC)的CIMP(CpG岛甲基剂表型)的特点是在CpG岛DNA甲基化累积且患者预后较差(Tian et al.，2014；Arai et al.，2012)。

SLC35B2在急性炎症期间唾液酸磺基Lex聚糖生物合成诱导时参与协调转录调控(Huopaniemi et al.，2004)，并在人结直肠癌细胞系中参与6个磺基乳糖胺表位的硫酸化(Kamiyama et al.，2006)。结直肠癌细胞以及人类结直肠组织表达SLC35B2(Kamiyama etal.，2011)。

PLOD1表达与人类乳腺癌进展相关(Gilkes et al.，2013)。

PRDX5在许多恶性肿瘤中上调(Urig and Becker，2006)，抑制PRDX5能阻止肿瘤的发生和进展，表明PRDX5为癌症治疗有前景的靶标。其高度亲核和易于接近的硒半胱氨酸活性位点可能是药物设计的主要靶标(Liu et al.，2012)。

PSMD8在周围肺细胞中表达增加可能对哪些临界细胞群体参与侵入性癌症发生提供潜在的信息(Zhou et al.，1996)。

SNRPD1是一个核心剪接蛋白，其在恶性肿瘤中上调。

SPTBN1表达下降与胰腺癌预后恶化有关(Jiang et al.，2010)。

SQSTM1作为各种信号转导途径的信号传导中心，如NF-κB信号传导、细胞凋亡和Nrf2活化，其失调与骨佩吉特病和肿瘤发生相关(Komatsu et al.，2012)。

PCNA表达可预测肛肠恶性黑色素瘤的生存期(Ben-Izhak et al.，2002)。PCNA(caPCNA)的癌症相关的同种型被确定其在PCNA内的众多谷氨酸和天冬氨酸残基上含有异常模式的甲酯基(Hoelz et al.，2006)。

在一些肿瘤细胞系中消耗SRP54不产生明显的细胞表型，如生长停滞或死亡，即使在SRP组分稳定还原的选定细胞中也是如此(Ren et al.，2004)。

在分子水平上，STAT1透过其能力增加细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21Cip1的表达或降低c-myc的表达来抑制接受IFN-γ治疗的小鼠和人肿瘤细胞的增殖(Ramana etal.，2000)。STAT1的抗肿瘤活性透过其抑制小鼠模型中的血管生成和肿瘤转移的能力进一步得到支持(Huang et al.，2002)。STAT1 mRNA水平增加被证明是分子信号的一部分，与激素受体阴性和三阴性乳腺癌患者的转移结果预后较好有关(Yau et al.，2010)。

滤泡状肿瘤的细针穿刺样本表明，与良性疾病相比，恶性结节过度表达STT3A(Patel et al.，2011)。

一项荟萃分析表明，STXBP4/COX11 rs6504950多态性与乳腺癌风险显著相关(Tang et al.，2012)。

由或基本上由本文所指氨基酸序列组成的一种肽可能有一个或两个非锚定氨基酸(见下面锚基序相关内容)被交换，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体(MHC)-I或-II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。在另一实施方案中，在基本上由本文所述氨基酸序列组成的肽中，一个或两个氨基酸可与其保守交换伙伴交换(见下文)，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体(MHC)-I或-II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。

本发明进一步涉及本发明的一种肽，其中所述肽按下文所述被修饰和/或包含非肽键。

本发明进一步涉及本发明的一种肽，其中所述肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸融合，或与抗体(例如，树突状细胞特定抗体，即与树突状细胞结合)或抗体的序列融合。

本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明的一种肽。本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。

本发明进一步涉及一种能表达、表达和/或表达本发明核酸的表达载体。

本发明进一步涉及本发明的一种肽、本发明的一种核酸或本发明的一种药用表达载体。

本发明进一步涉及下文进一步说明的抗体以及制造抗体的方法。优选为抗体特定于本发明的肽和/或与MHC结合时特定于本发明的肽。优选的抗体可以是单克隆的。

本发明进一步涉及T细胞受体(TCR)，特别是靶向作用于本发明肽的可溶性TCR(sTCR)和/或肽-其MHC复合体，以及制造它们的方法。

本发明进一步涉及靶向作用于本发明肽的抗体或其他结合分子和/或肽-其MHC复合体，以及制造它们的方法。

本发明进一步涉及含本发明核酸或前述表达载体的一种宿主细胞。本发明进一步涉及为一种抗原提呈细胞的本发明宿主细胞。本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其中抗原提呈细胞为树突细胞。

本发明还涉及适体。适体(例如，参见WO 2014/191359及其中引用的文献)是短的单链核酸或肽分子，其可以折迭为所定义的三维结构并识别特定的靶标结构。它们似乎是开发靶向治疗的合适替代方法。适体已显示可选择性与具有高亲和力和特异性的复合体靶标相结合。

识别细胞表面分子的适体在过去十年内已经确定，并为开发诊断和治疗方法提供了手段。由于适体已显示几乎无毒性和免疫原性，因此，它们是生物医学应用中有前景的候选物质。事实上适体，例如前列腺特异性膜抗原识别适体，已被成功地用于靶向治疗并在体内模型的异种移植物中显示出功能。此外，识别特定肿瘤细胞系的适体也已确定。

可选择DNA适体来揭示各种癌细胞的广谱标识属性，特别是那些来自于实体瘤的细胞，而非致瘤和主要健康细胞不被识别。如果所识别的适体不仅识别肿瘤特异性子类型，而且与一系列肿瘤相互作用，这使适体适用于作为所谓的广谱诊断和治疗手段。

此外，用流式细胞仪对细胞结合行为的研究显示，适体在纳摩尔范围内显示出很好的亲和力。

适体用于诊断和治疗目的。此外，也可能显示，一些适体被肿瘤细胞吸取，因而可作为抗癌剂靶向递送的分子赋形剂，例如siRNA进入肿瘤细胞。

可选择适体针对复合体的靶标，如细胞和组织以及包含、优选包括根据任何SEQlD NO 1至SEQ ID NO 300的一个序列、根据本发明的肽复合体与MHC分子，使用细胞SELEX(透过指数富集的配体系统进化)技术。

本文所用的″支架″一词是指与(如抗原)决定因子特异性结合的分子。在一项实施方案中，支架是能够引导其所连接的实体(例如，(第二)抗原结合部分)至目标靶点，例如，至特定类型的肿瘤细胞或承载抗原决定簇的肿瘤基质(如根据目前应用的肽的复合体)。在另一项实施例中，支架能够透过其靶抗原(例如T细胞受体复合体抗原)启动信号通路。支架包括但不限于抗体及其片段，抗体的抗原结合区，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区，结合的蛋白包括至少一个锚蛋白重复序列基元和单域抗原结合(SDAB)分子、适体、(可溶)TCR和(经修饰的)细胞，例如同种异体或自体T细胞。

各支架可包括一个标记，其透过确定是否存在或不存在卷标所提供的信号可检测到结合支架。例如，该支架可用荧光染料或任何其他适用的细胞标记分子进行标记。此类标记分子是本领域中公知的。例如，透过荧光染料进行的荧光标记可透过荧光或激光扫描显微术或流式细胞术提供结合适体的可视化。

各支架可与第二个活性分子(例如IL-21、抗CD3、抗CD28)共轭。例如，在WO 2014/071978A1背景技术部分对多肽支架进行了描述，并作为参考文献引用。

本发明进一步涉及制备本发明一种肽的一种方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞和从宿主细胞和/或其培养基中分离肽。

本发明进一步涉及一种体外制备启动的T细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动T细胞，其中所述抗原为本发明的至少一种肽。本发明进一步涉及一种方法，其中抗原透过与足够量的含抗原提成细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞表面的I或II类MHC分子。

本发明进一步涉及本发明的方法，其中该抗原提呈细胞包括一个表达载体，该载体有能力表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300的肽或其变体氨基酸序列。

本发明进一步涉及以本发明方法制备的启动T细胞，该方法有选择性地识别一种细胞，该细胞异常表达含一种本发明氨基酸序列的多肽。

本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明任何氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者本发明的有效量T细胞。

本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的一种核酸、本发明的一种表达载体、本发明的一种细胞、本发明一种作为药剂或制造药剂的启动T细胞的用途。

本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中所述药剂为一种疫苗，一种细胞，一种细胞群，例如，一个细胞系，sTCR和单克隆抗体。

本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中药剂可有效抗癌。

本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中所述癌细胞为HCC细胞。

本发明进一步涉及一种基于本发明肽的特定标志物蛋白和生物标志物，其可用于诊断和/或判断HCC的预后。

此外，本发明涉及这些供癌症治疗使用的新靶点。

此外，本发明涉及一种使用预筛选肿瘤相关肽的数据库(本文中也称为「存储库」)制备个性化抗癌疫苗用于单个患者的方法。

是否能刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。目前，针对癌症免疫治疗，正在探索利用免疫系统的体液和细胞进行免疫的各种机制。

细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的T-细胞表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8

本文所用″肽″这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常透过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，至长可为10、11、12或13个氨基酸长度，如果为MHC-II类肽时(本发明肽的拉长变体)，至长可为14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长度。

因此，″肽″这一术语应包括一系列氨基酸残基的盐，通常透过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。优选的情况是，盐为肽的药用盐，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)盐。必须注意的是，本发明肽的盐与其体内状态的肽基本上不同，因为该不是体内的盐。

术语″肽″应也包括″寡肽″。本文使用的术语″寡肽″是指一系列氨基酸残基，通常透过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于15个氨基酸。

″本发明的肽″这一术语应也包括根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300的上述肽组成的肽或包含该肽的肽。

″多肽″这一术语是指一系列氨基酸残基，通常透过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，多肽摂这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。

一种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有「免疫原性」(因此是本发明中的一种″免疫原″)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，″免疫原″是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽与MHC的复合体、和/或用于提高特异性抗体或TCR抗性的蛋白。

I类T细胞″表位″要求的是一种结合至MHC I类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可以透过T细胞负载匹配T细胞受体与具有适当亲和力的MHC/肽复合体结合来识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。

在人类中，有三种编码MHC I类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A＊01、HLA-A＊02和HLA-B＊07是可从这些基因位点表达的不同MHC I类等位基因的实例。

表6：HLA-A＊02和HLA-A＊24和最常见HLA-DR血清类型的表达频率F。频率根据Mori等人(Mori M，et al.HLA gene and haplotype frequencies in the NorthAmerican population：the National Marrow Donor Program Donor Registry.Transplantation.1997Oct 15；64(7)：1017-27)使用的Hardy-Weinberg公式F＝1-(1-G

本发明的肽，优选当如本文描述纳入本发明的疫苗时与A＊02或A＊24结合。疫苗还可能包括泛结合MHC II类肽。因此，本发明的疫苗可用于治疗A＊02阳性、A＊24阳性或A＊02和A＊24均呈阳性患者中的癌症，但不因为这些肽的广泛结核性而必须选择II类MHC同种异型。

一种疫苗中A＊02和A＊24肽组合具有优势，即与单独的MHC I类等位基因相比，可治疗更高比例的患者群体。虽然在大多数人群中，低于50％的患者可由单独的等位基因来解决问题，但是本发明的疫苗可以治疗任何相关人群中至少60％的患者。具体来说，各区域中，以下比例的患者这些等位基因中的至少一个有肯定效果：美国61％、西欧62％、中国75％、韩国77％、日本86％(根据www.allelefrequencies.net计算)。

本文提到的DNA序列既包括单链DNA也包括双链DNA。因此，除非本文另有所指，否则具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双工(双链DNA)以及该序列的互补序列。″编码区″这一术语是指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。

编码区可来自非突变(″正常″)基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。

在一项优选的实施方案中，术语″核苷酸序列″系指脱氧核苷酸的杂聚物。

编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。

如本文所用的术语″肽的核苷酸编码″系指对肽进行核苷酸序列编码，其中该肽包括与将由用于产生TCR的树突细胞或另一细胞系统所表达该序列的生物系统兼容的人工(人造)启动和停止密码子。

″表达产物″这一术语是指多肽或蛋白，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的翻译产物。

″片断″这一术语，当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。

″DNA片段″这一术语是指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不含污染性内源性材料，并且获得的数量或浓度能够使用标准生化方法，例如使用克隆载体，进行识别、操纵和回收该片段及其组分核苷酸序列。此类片段以开放阅读框架(未被内部未翻译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。

″引物″这一术语表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3′-OH末端。

″启动子″这一术语表示参与RNA聚合酶的结合从而启动转录的DNA区域。

术语″分离″表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。

本发明中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以″纯化″的形式存在。术语″纯化″并非要求绝对的纯度；它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，各个从已用传统方法纯化为具有电泳同构型的cDNA库中分离出的各种克隆物。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确考虑到所述多肽的纯度优选为99.999％，或至少为99.99％或99.9％；甚而适宜为以重量计99％或更高。

根据本发明公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可能以″浓缩的形式″存在。本文使用的术语″浓缩″是指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，有优势的是，按重量计为0.01％，优选为至少0.1％。也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本发明的其他材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。

″活性片段″这一术语是指产生免疫反应的片段(即具有免疫原性活性)，通常是一种肽、多肽或核酸序列的片段，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起或在载体中给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫反应采用的形式是在接受动物(如：人)体内刺激T细胞反应。或者，″活性片段″也可用于诱导体外T细胞反应。

本文使用的″部分″(portion)、″节″(segment)、″片段″(fragment)这几个术语，当与多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语系指用任何核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。

根据本发明，术语″相同百分比″、″等同度百分比″或″等同百分比″，如果指的是序列，则表示在待对比序列(「被对比序列」)与所述序列或权利要求的序列(″参考序列″)对准之后将被对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：

等同度百分比＝100[1-(C/R)]

其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中

(i)参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基酸；

(ii)参考序列中每个空隙，以及

(iii)参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同，即构成一个差异以及

(iiii)必须在对准序列的第1位置开始对准；

并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个碱基或氨基酸的参考序列中的碱基或氨基酸数目。

如果″被对比序列″和″参考序列″之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等同度百分比，虽然可能存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对准。

如果无另有说明，那么本文公开的原始(未修饰)肽可以透过在肽链内的不同(可能为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。优选情况时，这些取代位于氨基酸链的末端。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性之间的相似性相关，这是确定″保守取代″的基础。

在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1-小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3-极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)；基团4-大脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5-大芳香残基(Phe，Tyr，Trp)。

较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种″激进″取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。

当然，这种取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他结构。因此，D-氨基酸可能被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，具有非标准R基团的氨基酸(即，除了天然蛋白的20个常见氨基酸之外的R基团)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明的免疫原和免疫原性多肽。

如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的迭加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。

本发明的肽可被拉长多达四个氨基酸，即1、2、3或4个氨基酸，可按照4：0与0：4之间的任何组合添加至任意一端。

本发明的拉长组合情况如表7所示：

拉伸/延长的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。拉长可用于增强所述肽的稳定性或溶解性。

术语″T细胞反应″是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和启动。对于MHC I类限制性CTL，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素-γ，TNF-α或IL-2，分泌效应分子，优选为肽诱导的颗粒酶或穿孔素，或脱颗粒。

优选情况是，当本发明的肽特异性T细胞相比于取代肽受到检测时，如果取代肽在相对于背景肽溶解度增加达到最大值的一半，则该肽浓度不超过约1mM，优选为不超过约1μM，更优选为不超过约1nM，再优选为不超过约100pM，最优选为不超过约10pM。也优选为，取代肽被一个以上的T细胞识别，最少为2个，更优选为3个。

因此，本发明所述的表位可能与天然肿瘤相关表位或肿瘤特异性表位相同，也可能包括来自参考肽的不超过四个残基的不同肽，只要它们有基本相同的抗原活性即可。

MHC-I类分子，在细胞核提呈因主要内源性、细胞质或细胞核蛋白质、DRIPS和较大肽蛋白裂解产生的肽的细胞上都能发现此类分子。然而，源自内体结构或外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式在文献中被称为交叉提呈。

由于CD8及CD4依赖型反应共同和协同促进抗肿瘤作用，因此，CD8阳性T细胞(MHC-I分子)或CD4阳性T细胞(MHC-II类分子)对肿瘤相关抗原的识别和鉴定对开发肿瘤疫苗非常重要。因此，提出含有与任一类MHC复合体结合的肽组合物是本发明的一个目标。

考虑到治疗癌症相关的严重副作用和费用，迫切需要更好的预后和诊断方法。因此，有必要确定代表癌症生物标志物的其他因子，尤其是HCC。此外，有必要确定可用于治疗癌症的因子，尤其是HCC。

本发明提出了有利于治疗癌肿/肿瘤，优选为治疗过量提呈或只提呈本发明肽的HCC。这些肽由质谱分析法直接显示出，而由HLA分子自然提呈于人原发性人HCC样本中。

与正常组织相比，癌症中高度过度表达肽来源的源基因/蛋白质(也指定为″全长蛋白质″或″潜在蛋白质″)-本发明相关的″正常组织″是健康肝细胞或其他正常组织细胞，这表明肿瘤与这些源基因的高度关联性(见实施例2)。此外，这些肽本身也在肿瘤组织中过度提呈(本发明相关的″肿瘤组织″是指来自HCC患者的样本)，但不在正常组织中过度提呈(见实施例1)。

HLA结合肽能够被免疫系统识别，特别是T淋巴细胞。T细胞可破坏提呈被识别HLA/肽复合体的细胞(如：提呈衍生肽的HCC细胞)。

本发明的所有肽已被证明具有刺激T细胞反应的能力，并过量提呈，因而可用于制备本发明的抗体和/或TCR，特别是sTCR(参见实施例3)。此外，肽与相应的MHC组合时，也可用于制备本发明的抗体和/或TCR，特别是sTCR。各个方法均为技术人员所熟知，并在各个文献中可找到。因此，本发明的肽可用于在患者中产生免疫反应，从而能够毁灭肿瘤细胞。患者的免疫反应能够透过直接给予患者所述肽或前体物质(如，加长肽、蛋白或编码这些肽的核酸)，较理想是与加强免疫原性的制剂相结合，而进行诱导。源自该治疗性疫苗的免疫反应预期能够高度特异性地对抗肿瘤细胞，因为本发明的目标肽在正常组织上提呈的复制数目较少，防止患者发生对抗正常细胞的不良自体免疫反应的风险。

优选的″药物组合物″是指优选适合在医疗机构用于人体的组合物。优选地，药物组合物为无菌状态，并根据GMP指南生产。

药物组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽(也参见上文)。此处使用的″药用盐″系指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制酸或药剂的碱盐进行改性。例如，用与适合的酸反应的游离碱(通常其中的中性药物有一个中性-NH

在特别优选的实施例中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)，三氟乙酸盐或盐酸(氯化物)形式的肽。

特别优选的是一种组合物和/或所述组合物例如以疫苗形式使用，其包括具有SEQlD NO 1、2、7、225、228、301、303和312的肽或具有SEQ ID NO 1、2、7、225、228、301、303和312序列的肽反应性支架，及其MHC分子复合体。

本发明的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由HCC细胞产生，并且已确定这些肽在正常组织中不存在或水平较低，因此这些肽可用于诊断癌症是否存在。

血液样本中组织活检物含权利要求的肽，可有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱或其他本领域内已知的方法检测某些肽可使病理师判断该组织样本为恶性的还是炎症或一般病变，也可用作HCC的生物标志物。肽基团的提呈使得能对病变组织进行分类或进一步分成子类。

对病变标本中肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的利益进行判断，特别是如果T-淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪些受感染的恶性细胞逃避了免疫监视。因此，肽的提呈表明，分析过的细胞并没有利用这种机制。

本发明的肽可用于分析淋巴细胞对肽的反应(如T细胞反应)，或抗体对肽或MHC分子络合的肽发生的反应。这些淋巴细胞反应可以作为预后指标，决定是否采取进一步的治疗。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代指标，旨在以不同方式诱导淋巴细胞反应，如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，淋巴细胞对肽发生的反应可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞反应监测也可能成为移植疗法随访检查中的一种有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。

本发明中的肽可用于生成和开发出针对MHC/肽复合体的特定抗体。这些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如PET)将放射性核素靶向病变组织。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和准确位置。

因此，本发明的另一方面是提出产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性复合体(MHC)的一种重组抗体的方法，该方法包括：用可溶形式的与HLA限制性抗原络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所述非人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个噬菌体显示库，显示由所述mRNA分子编码的蛋白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显示所述抗体特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类。

本发明的另一方面提出一种抗体，其特异性结合至与一种HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性说复合体(MHC)，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体和/或嵌合抗体。

此外，本发明的另一个方面涉及产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性复合体(MHC)的一种抗体的方法，该方法包括：用可溶形式的与HLA限制性抗原络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所述非人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个噬菌体显示库，显示由所述mRNA分子编码的蛋白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显示所述抗体可特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类。产生这种抗体和单链I类主要组织兼容性复合体的相应方法，以及产生这些抗体的其他工具在WO 03/068201、WO2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752以及Cohen CJ，et al.Recombinant antibodieswith MHC-restricted，peptide-specific，T-cell receptor-like specificity：newtools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions.J MolRecognit.2003Sep-Oct；16(5)：324-32.；Denkberg G，et al.Selective targeting ofmelanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificitydirected toward a melanoma differentiation antigen.J Immunol.2003Sep 1；171(5)：2197-207；以及Cohen CJ，et al.Direct phenotypic analysis of human MHC classl antigen presentation：visualization，quantitation，and in situ detection ofhuman viral epitopes using peptide-specific，MHC-restricted human recombinantantibodies.J Immunol.2003Apr 15；170(8)：4349-61中进行了披露，为了本发明之目的，所有参考文献透过引用被完整地并入本文。

优选地，该抗体与复合体的结合亲和力低于20纳摩尔，优选为低于10纳摩尔，这在本发明情况下被视为具有揬

本发明的另一方面提出了制备识别特异性肽-MHC复合体的可溶性T细胞受体(sTCR)的一种方法。这种可溶性T细胞受体可从特异性T细胞克隆中产生，并且它们的亲和力可以透过互补决定区靶向诱变而增加。为了T细胞受体选择之目的，可以使用噬菌体展示(美国2010/0113300，Liddy N，et al.Monoclonal TCR-redirected tumor cellkilling.Nat Med 2012Jun；18(6)：980-987)。为了在噬菌体展示期间以及实际使用为药物时稳定T细胞受体之目的，可透过非天然二硫键、其他共价键(单链T细胞受体)或透过二聚化结构域连接α和β链(参见Boulter JM，et al.Stable，soluble T-cell receptormolecules for crystallization and therapeutics.Protein Eng 2003Sep；16(9)：707-711.；Card KF，et al.A soluble single-chain T-cell receptor IL-2fusion proteinretains MHC-restricted peptide specificity and IL-2bioactivity.Cancer lmmunolImmunother2004Apr；53(4)：345-357；以及Willcox BE，et al.Production of solublealphabeta T-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis ofligand binding.Protein Sci1999Nov；8(11)：2418-2423)。T细胞受体可以连接到毒素、药物、细胞因子(参见US 2013/0115191)、结构域招募效应细胞，如抗CD3结构域等，以便对靶细胞执行特定的功能。此外，它可能表达于用于过继转移的T细胞。进一步的信息可在WO2004/033685A1和WO 2004/074322A1中找到。sTCR的组合在WO 2012/056407A1中进行了描述。WO 2013/057586A1中公开了制备的进一步的方法。

此外，可用本发明的肽和/或TCR或抗体或其他结合分子在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。

为了选择过度提呈的肽，计算了提呈图，其显示样本中位提呈量以及复制变化。该特点使相关肿瘤实体的样本与正常组织样本的基线值并列。透过计算调节线性混合效应模型(J.Pinheiro，et al.The nlme Package：Linear and Nonlinear Mixed EffectsModels.2007)的p值可以将以上每个特点并入过度提呈分数中，从而透过假发现率调整多项检验(Y.Benjamini and Y.Hochberg.Controlling the False Discovery Rate：APractical and Powerful Approach to Multiple Testing.Journal of the RoyalStatistical Society.Series B(Methodological)，Vol.57(No.1)：289-300，1995)。

对于透过质谱法对HLA配体的识别和相对定量，对来自冲击冷冻组织样本的HLA分子进行纯化并对HLA相关肽进行分离。分离的肽分开，并透过在线纳米-电喷雾-电离(nanoESI)液相色谱-谱(LC-MS)实验进行鉴定。由此产生的肽序列的验证方法是，将HCC样本(N＝16个A＊02-阳性样本，包括13个A＊02：01-阳性样本，N＝15个A＊24-阳性样本)中记录的天然TUMAP的片段模式与相同序列相应合成参考肽的片段模式进行比较。由于这些肽被直接鉴定为原发性肿瘤HLA分子的配体，因此这些结果为获得自31名HCC患者的原发性癌症组织上确定肽的天然加工和提呈提供了直接证据。

发现管道

为每种肽和样本确立了提呈水平，包括误差估计值。肿瘤组织大量提呈的肽以及肿瘤与非肿瘤组织和器官中过量提呈的肽已经得到确定。

对来自HCC组织样本的HLA肽复合体进行纯化，并且对HLA相关肽使用LC-MS进行分离和分析(见实施例)。本申请中包含的所有TUMAP使用原发性HCC样本的方法进行鉴定，确认其在原发性HCC上的提呈。

在多个HCC肿瘤和正常组织上确定的TUMAP用无标记LC-MS数据的离子计数方法进行量化。该方法假定肽的LC-MS信号区域与样本中其丰度相关。各种LC-MS实验中肽的所有量化信号在集中趋势基础上进行正常化，根据每个样品进行平均，并合并入柱状图(被称为提呈图)。提呈图整合了不同分析方法，如：蛋白数据库检索、谱聚类、充电状态卷积(除电)和保留时间校准和正态化。

本发明涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300的组的一个序列或该序列的与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300具有90％同源性(优选为相同)的一种变体，或诱导与所述变异肽发生T细胞交叉反应的一种变体，其中，所述肽不是基本的全长多肽。

本发明进一步涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300的组的一个序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300具有至少90％同源性(优选为相同)的一种变体，其中所述肽或变体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸。

本发明进一步涉及本发明的肽，其具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合的能力。

本发明进一步涉及本发明中的肽，其中肽系由或基本系由根据SEQ ID NO：1至SEQID NO：300的一个氨基酸序列组成。

本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽(在化学上)被修饰和/或包含非肽键。

本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽为融合蛋白的一部分，特别包括HLA-DR抗原相关不变链(li)的N-端氨基酸，或其中该肽与一种抗体(例如，树突状细胞特定抗体)融合。

本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明所述肽，前提是该肽并非完整(完全)的人蛋白。

本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。

本发明进一步涉及一种能表达本发明核酸的表达载体。

本发明进一步涉及本发明的一种肽、本发明的一种核酸或本发明的一种药用表达载体，特别是用于治疗HCC。

本发明进一步涉及含本发明核酸或本发明表达载体的一种宿主细胞。

本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。

本发明进一步涉及本发明中的方法，其中抗原透过与足够量的含抗原提成细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞表面的I或II类MHC分子。

本发明进一步涉及本发明的方法，其中该抗原提呈细胞包括一个表达载体，该载体有能力表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300的肽或所述变体氨基酸序列。

本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的一种核酸、本发明的一种表达载体、本发明的一种细胞、本发明一种作为药剂或制造药剂的启动细胞毒性T淋巴细胞的用途。本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中药剂可有效抗癌。

本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中该药剂为一种疫苗。本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中药剂可有效抗癌。

本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中所述癌细胞为HCC细胞或其他实体或血液学肿瘤细胞，例如，胰腺癌、脑癌、肾癌、结肠癌或直肠癌或白血病。

本发明进一步涉及一种基于本发明肽的特定标志物蛋白和生物标志物，在此成为靶标摂，其可用于诊断和/或判断HCC的预后。本发明还涉及这些供癌症治疗使用的新靶点。

本文中术语″抗体″为广义上的定义，既包括多克隆也包括单克隆抗体。除了完整或「全部」的免疫球蛋白分子，″抗体″这一术语还包括这些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段(如，CDR、Fv、Fab和Fc片段)或聚合物，只要它们表现出本发明的任何期望属性(例如，HCC标志物多肽的特异性结合、将毒素传递给HCC细胞标志物基因表达水平增加时的HCC细胞和/或抑制HCC标志物多肽的活性)。

只要有可能，本发明的抗体可从商业来源购买。本发明的抗体也可能使用已知的方法制得。技术人员会了解全长HCC标志物多肽或其片段可用于制备本发明的抗体。用于产生本发明抗体的多肽可部分或全部地由天然源经纯化而得，也可利用重组DNA技术生产。

例如，本发明的编码肽的cDNA，例如，该肽为根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：30多肽的肽，或其中一个变体或片段，可在原核细胞中(如：细菌)或真核细胞(如：酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中表达，之后，可纯化重组蛋白，并用于产生一种特异性结合用于产生本发明抗体的HCC标志物多肽的单克隆或多克隆抗体制剂。

本领域的技术人员会认识到，两种或两种以上不同集合的单克隆抗体或多克隆抗体能最大限度地增加获得一种含预期用途所需的特异性和亲和力(例如，ELISA法、免疫组织化学、体内成像、免疫毒素疗法)的抗体的可能性。根据抗体的用途，用已知的方法对其期望活性进行测试(例如，ELISA法、免疫组织化学、免疫治疗等；要获取产生和测试抗体的进一步指导，请参阅，例如，Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988，new 2

此处使用的术语″单克隆抗体″系指从大量同质抗体中获得的一种抗体，即，由相同的抗体组成的抗体群，但可能少量提呈的自然突变除外。此处所述的单克隆抗体具体包括″嵌合″抗体，其中一部分重链和/或轻链与从特定物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和分类型抗体的相应序列相同(同质)，同时，剩余链与从其他物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和子类型抗体的相应序列以及这些抗体的片段相同(同质)，只要它们表现出预期的拮抗活性(美国4816567号专利，其在此以其整体并入)。

本发明的单克隆抗体可能使用杂交瘤方法制得。在杂交瘤方法中，老鼠或其他适当的宿主动物，通常用免疫制剂以引发产生或能产生将特异性结合至免疫制剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫。

单克隆抗体也可由DNA重组方法制得，如：美国4816567号专利所述。编码本发明单克隆抗体的DNA可很容易地使用传统程序进行分离和测序(例如：透过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。

体外方法也适用于制备单价抗体。抗体消化以产生抗体的片段，尤其是Fab片段，可以透过使用本领域已知的常规技术完成。例如，可以透过使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的实施例在WO 94/29348和美国4342566号专利中有描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两种相同的抗原结合性片段，称为Fab片段(每个片段都有一个抗原结合点)和残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生aF(ab′)

抗体片段，不论其是否附着于其他序列，均可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、删除、替换、或其他选择性修饰，但前提是，片段的活性与非修饰的抗体或抗体片段相比没有显著的改变或损害。这些修饰可提供一些额外的属性，如：删除/添加可与二硫键结合的氨基酸，以增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体片段必须拥有生物活性的特性，如：结合活性、调节结合域的结合力等。抗体的功能性或活性区域可透过蛋白特定区域的基因突变、随后表达和测试所表达的多肽进行确定。这些方法为本行业技术人员所熟知，可包括编码抗体片段的核酸的特定位点基因突变。

本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(如：鼠)抗体的人源化形式为嵌合抗体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如：Fv、Fab、Fab′或抗体的其他抗原结合序列)，其中包含从非人免疫球蛋白中获得的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有与其特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的残基取代。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基取代。人源化抗体可能还包括既非受体抗体、也非输入CDR或框架序列中发现的残基。一般来说，人源化抗体将包括几乎所有的至少一个、通常为二个可变域，其中，全部或几乎全部的CDR区域均对应于非人免疫球蛋白的区域并且全部或几乎全部的FR区域均为人免疫球蛋白相同序列的区域。理想情况是，人源化抗体还将包括至少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。

人源化非人抗体的方法为本行业所熟知。一般来说，人源化抗体具有一个或多个从非人源头引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基往往被称为″输入″残基，通常从″输入″可变结构域中获得。人源化基本上可以透过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为相应的人抗体序列而完成。因此，这种″人源化″抗体为嵌合抗体(美国4816567号专利)，其中大大少于完整的人可变结构域被来自于非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其中有些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。

可使用免疫后在内源性免疫球蛋白产生缺失时能产生完整人抗体的转基因动物(如：小鼠)。例如，它被描述为，嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区域基因的纯合性缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。在此种系变种小鼠中人种系免疫球蛋白基因数组的转移在抗原挑战后将导致人抗体的生成。人抗体也可在噬菌体展示库中产生。

本发明的抗体优选为透过药用载体的形式给予受试者。通常，在制剂中使用适量的药用盐，以使制剂等渗。药用载体的例子包括生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选为约5至8，更优选为约7至7.5。此外，载体还包括缓释制剂，如：含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，其中基质为有形物品形式，如：薄膜、脂质体或微粒。本行业的技术人员熟知，某些载体可能为更优选，取决于例如，抗体的给药途径和浓度。

该抗体可透过注射(如：静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内)或透过输注等其他方法给予受试者、患者或细胞，确保其以有效的形式传输到血液中。这些抗体也可以透过瘤内或瘤周途径给予，从而发挥局部和全身的治疗作用。局部或静脉注射为优选。

抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定，并且作出此类决定属本行业的技术范围内。本行业的技术人员会明白，必须给予的抗体剂量根据以下因素会有所不同，例如：接受抗体的受试者、给药途径、使用的抗体以及其他正在使用的药物的特定类型。单独使用的抗体的通常日剂量可能为约1μg/kg至最多100mg/kg体重或更多，这取决于上述因素。给予抗体，优选为治疗HCC后，治疗抗体的疗效可透过技术人员熟知的不同方法评估。例如：接受治疗的受试者癌症的大小、数量和/或分布可使用标准肿瘤成像技术进行监测。因治疗而给予的抗体与不给予抗体时的病程相比，可阻止肿瘤生长、导致肿瘤缩小、和/或阻止新肿瘤的发展，这样的抗体是一种有效治疗癌症的抗体。

由于本发明上述表格中提及的肽以及其潜在的多肽在HCC中呈高表达，而在正常细胞中表达极低，抑制选自包括以下基因的蛋白产物的组的一种蛋白：优选用于抑制和抗体和/或TCR抵抗的是GLUL、GPAM、PLIN2、SLC16A1、SLC9A3R1、PCBD1、SEC16A、AKR1C4、ABCB11、HAL、CYP2E1、C4A、C4B、ALDH1L1、CRP、ACSL4、EEF2、HLTF、FBXO22、GALK1、TMCO1、TMEM33、ZNF318、IPO9、AMACR、C1QTNF3、CYP4F8、CYP4F3、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F2、MOCOS、A1CF、COL18A1、HPR、LBP、C19orf80、CFHR5、ITIH4、TMEM110、LARP4、LMF2、SLC10A5和SLC16A11；进一步优选用于抑制和抗体和/或TCR抵抗的是ANKFY1、C12orf44、C16orf58、CPSF1、DCAF8、PEX19、DDX11、DDX12P、DECR2、NME4、DENND5B、DYM、EDC4、ERI3、FAM20A、FNDC3A，GPR107、GYG2、HEATR2、IFT81、KCTD3，SHKBP1、KIAA1324L、KLHL24、MARCH6、MBTPS2、MlR1279、CPSF6、NOC4L、NXF1、PANK2、PCNXL3、PIPSL、PSMD4、PSMD14、SLC35B1、TCP11L2、THNSL2、THOC2、TOMM5、TRAPPC6B、TRIM54、TRIM55、TRIM63、UGGT2、URB1、VPS54、WIZ、ZNF451、RFTN2、SCFD1、SERINC5、CCT7P2、CMAS、ANKS1A、C17orf70、CCT7、CDK5RAP2、CLPTM1，最优选用于抑制和抗体和/或TCR抵抗的是APOB、FASN和/或COPA；这些标志物的表达或其活性可优选融入治疗或预防HCC的治疗策略中。

反义治疗的原理是基于这样的假设：基因表达的序列特异性抑制(透过转录或翻译)可能是透过基因组DNA或mRNA与互补反义种类之间的杂交而实现。这种杂交核酸双工的形成干扰目标肿瘤抗原编码基因组DNA的转录，或目标肿瘤抗原mRNA的加工/运输/翻译和/或稳定性。

反义核酸可用各种方法传递。例如，反义寡核苷酸或反义RNA可以让肿瘤细胞吸收的方式直接给予(例如，透过静脉注射)受试者。另外，编码反义RNA(或RNA片段)的病毒或质粒载体可导入体内细胞。还可透过有义序列诱发反义效果；然而，表型变化的程度大不相同。透过有效的反义治疗诱导的表型变化可根据，例如，靶mRNA水平、靶蛋白水平、和/或靶蛋白活性水平的变化进行评估。

在一个具体的实施例中，可透过直接向受试者给予反义肿瘤标志物RNA而实现反义基因治疗抑制HCC靶标/标志物。肿瘤标志物反义RNA可透过任何标准技术制造和分离，但最容易的制造方法是在控制高效启动子(例如，T7启动子)的情况下使用肿瘤标志物反义cDNA经体外转录制得。肿瘤标志物反义RNA给到细胞可透过下文所述的核酸直接给药方法中的任何一种进行。

用于抑制选自上述蛋白质(最优选APOB、FASN和/或COPA)组成的组中的蛋白功能的替代策略涉及使用核酸(例如，siRNA或编码抗蛋白抗体或其部分的核酸，这可被转入癌细胞或其他细胞，导致细胞内抗体表达和分泌)、蛋白质或小分子、或针对此蛋白的表达、翻译和/或生物功能的任何其他复合体。

在上述的方法中，其中包括将外源性DNA给入受试者的细胞并被其吸收(即，基因转导或转染)，本发明的核酸可为裸露DNA形式或核酸可位于载体中将核酸传递至细胞以抑制HCC标志物蛋白的表达。该载体可以是一种市售的制剂，如腺病毒载体(量子生物技术公司，Laval，Quebec，Canada)。核酸或载体可透过多种机制传递至细胞中。例如，可使用市售的脂质体，如：Lipofectin、Lipofectamine(GIBCO-25BRL公司，Gaithersburg，Md.)、Superfect(Qiagen公司，Hilden，Germany)和Transfectam(Promega Biotec公司，Madison，Wis.，US)以及根据本领域标准程序开发的其他脂质体，透过这些脂质体传递。此外，本发明的核酸或载体可透过体内电穿孔传递，该技术可从Genetronics公司(San Diego，US)获得，以及透过Sonoporation机(ImaRx制药公司，Tucson，Arizona，US)的方式传递。

例如，载体可透过病毒系统(如可包裹重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统)传递。重组逆转录病毒可用于感染，从而传递至抑制选自包括上述蛋白的组的蛋白质表达的受感染细胞反义核酸。当然，将改变的核酸准确地导入至哺乳动物细胞细胞内并不限于使用逆转录病毒载体。对于这一程序有广泛的其他技术可供使用，包括使用腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、假型逆转录病毒载体。也可使用物理转导技术，如脂质体传递和受体介导的及其它内吞作用机制。本发明可与这些技术或其他常用基因转移方法中的任何方法配合使用。

该抗体也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体用放射性核素标记(如：

诊断用抗体可透过各种影像学方法使用适合检测的探针进行标记。探针检测方法包括但不限于，荧光、光、共聚焦和电镜方法；磁共振成像和光谱学技术；透视、计算机断层扫描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，荧光素、罗丹明、曙红及其它荧光团、放射性同位素、黄金、钆和其他稀土、顺磁铁、氟-18和其他正电子发射放射性核素。此外，探针可能是双功能或多功能的，并且用一种以上的上述方法可进行检测。这些抗体可用所述的探针直接或间接进行标记。抗体探针的连接，包括探针的共价连接、将探针融合入抗体、以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其他本行业熟知的方法。对于免疫组织化学方法，疾病组织样本可能是新鲜或冷冻或可能包埋于石蜡中以及用福尔马林等防腐剂固定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的样本，其中该抗体用于检测原位蛋白的表达。

因此，如上所述，本发明提出了一种肽，其包括选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300群组的一个序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300具有90％同源性的其变体、或诱导与该肽发生T细胞交叉反应的一个变体。本发明所诉的肽具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或所述肽拉长版本的II类分子结合的能力。

在本发明中，″同源性″一词系指两个氨基酸序列之间的同一度(参见上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的″同源″是透过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此类序列同源性可透过使用ClustalW等算法创建一个排列而进行计算。也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是Vector NTI、GENETYX或由公共数据库提供的其他分析工具。

本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应(Fong L，et al.Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expandeddendritic cells for tumor immunotherapy.Proc Natl Acad Sci USA.2001Jul 17；98(15)：8809-14：Zaremba S，et al.Identification of an enhancer agonist cytotoxicT Iymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen.Cancer Res.1997Oct15；57(20)：4570-7；Colombetti S，et al.Impact of orthologous melan-A peptideimmunizations on the anti-self melan-A/HLA-A2 T cell cross-reactivity.JImmunol.2006Jun 1；176(11)：6560-7；Appay V，et al.Decreased specific CD8+ T cellcross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-Apeptide.Eur J Immunol.2006Jul；36(7)：1805-14)。

发明人用给定氨基酸序列的″变体″表示，一个或两个氨基酸残基等的侧链透过被另一个天然氨基酸残基的侧链或其他侧链取代而发生改变，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列(由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300组成)的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如没有提高)其能与HLA-A＊02或-DR等合适MHC分子的结合槽相互作用和结合，以及至少维持(如没有提高)其与启动T细胞的TCR结合的能力。

随后，这些T细胞可与细胞和杀伤细胞发生交叉反应，这些细胞表达多肽(其中包含本发明中定义的同源肽的天然氨基酸序列)。正如科学文献(Godkin A，et al.Use ofeluted peptide sequence data to identify the binding characteristics ofpeptides to the insulin-dependent diabetes susceptibility allele HLA-DQ8(DQ3.2).Int Immunol.1997Jun；9(6)：905-11)和数据库(Rammensee H.et al.SYFPEITHI：database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics.1999Nov；50(3-4)：213-9)中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合模序相称的核心序列，其定义由构成结合槽的多肽链的极性、电物理、疏水性和空间特性确定。因此，本领域技术人员能够透过保持已知的锚残基来修饰SEQ ID No：1至SEQ ID NO：300提出的氨基酸序列，并且能确定这些变体是否保持与MHC I或II类分子结合的能力。本发明的变体保持与启动T细胞的TCR结合的能力，随后，这些T细胞可与表达一种包含本发明定义的同源肽的天然氨基酸序列的多肽的细胞发生交叉反应并杀死该等细胞。

这些基本不与T细胞受体互动的氨基酸残基可透过取代另一个几乎不影响T细胞反应并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本发明的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或部分或其变体的肽(发明人所用的这个术语包括寡肽或多肽)。

这些基本不与TCR体互动的氨基酸残基可透过取代另一个几乎不影响T细胞反应并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本发明的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或部分或其变体的肽(发明人所用的这个术语包括寡肽或多肽)。

表8：根据SEQ ID NO：1、117和246的肽变体和基序

较长的肽也可能适合。MHC I类表位(通常长度为8至11个氨基酸)也可能由肽从较长的肽或包含实际表位的蛋白中加工而产生。两侧有实际表位的残基优选为在加工过程中几乎不影响暴露实际表位所需蛋白裂解的残基。

因此，本发明提出了MHC I类表位的肽和变体，其中所述肽或抗体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸长度(即10、11、12、13、14个氨基酸，如果为拉长II类结合肽时，长度也可为15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸)。

当然，本发明的肽或变体能与人主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合。肽或变体与MHC复合体的结合可用本领域内的已知方法进行测试。

在本发明的一个特别优选实施方案中，肽系由或基本系由根据SEQ ID NO：1至SEQID NO：300所选的氨基酸序列组成。

″基本由...组成″系指本发明的肽，除了根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300中的任一序列或其变体组成外，还含有位于其他N和/或C端延伸处的氨基酸，而它们不一定能形成作为MHC分子表位的肽。

但这些延伸区域对有效将本发明中的肽引进细胞具有重要作用。在本发明的一实施例中，该肽为融合蛋白的一部分，含来自NCBI、GenBank登录号X00497的HLA-DR抗原相关不变链(p33，以下称为″Ii″)的80个N-端氨基酸等。在其他的融合中，本发明的肽可以被融合到本文所述的抗体、或其功能性部分，特别是融合入抗体的序列，以便所述抗体进行特异性靶向作用，或者，例如进入本文所述的树突状细胞特异性抗体。

此外，该肽或变体可进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子结合，从而引发更强的免疫反应。肽序列的该类优化方法是本领域内所熟知的，包括，例如，反式肽键和非肽键的引入。

在反式肽键氨基酸中，肽(-CO-NH-)并未连接其残基，但是其肽键是反向的。这种逆向反向模拟肽(retro-inverso peptidomimetics)可透过本领域已知的方法制备，例如：Meziere等在《免疫学杂志》((1997)J.Immunol.159，3230-3237)中所述的方法，以引用的方式并入本文。这种方法涉及制备包含骨架(而并非侧链)改变的模拟肽。Meziere等人(1997年)的研究显示，这些模拟肽有利于MHC的结合和辅助性T细胞的反应。以NH-CO键替代CO-NH肽键的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。

非肽键为-CH

含上述序列的肽可与其氨基和/或羧基末端的其他化学基团进行合成，从而提高肽的稳定性、生物利用度、和/或亲和力等。例如，苄氧羰基、丹酰基等疏水基团或叔丁氧羰基团可加入肽的氨基末端。同样，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，疏水基团、叔丁氧羰基团或氨基团都可能被加入肽的羧基末端。

另外，本发明中的所有肽都可能经合成而改变其空间构型。例如，可能使用这些肽的一个或多个氨基酸残基的右旋体，通常不是其左旋体。更进一步地，本发明中肽的至少一个氨基酸残基可被熟知的一个非天然氨基酸残基取代。诸如此类的改变可能有助于增加本发明肽的稳定性、生物利用度和/或结合作用。

同样，本发明中的肽或变体可在合成肽之前或之后透过特异氨基酸的反应而进行化学修饰。此类修饰的实施例为本领域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《ChemicalReagents for Protein Modification》(3rd ed.CRC Press，2005)中有概述，以参考文献的方式并入本文。虽然氨基酸的化学修饰方法无限制，但其包括(但不限于)透过以下方法修饰：酰基化、脒基化、赖氨酸吡哆基化、还原烷基化、以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基团、透过将半胱氨酸过甲酸氧化为磺基丙氨酸而对羧基团和巯基进行氨基修饰、形成易变衍生物、与其他巯基化合物形成混合二硫化合物、与马来酰亚胺反应，与碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在碱性pH值下与氰酸盐甲氨酰化。在这方面，技术人员参考了《Current Protocols In Protein Science》(Eds.Coligan et al.(John Wiley and SonsNY 1995-2000))中第15章所述的在蛋白质化学修饰相关的广泛方法。

简言之，修饰蛋白质的精氨酰残基等往往基于于邻二羰基化合物(如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮以及1，2-烯巳二酮)的反应而形成加合物。另一个实施例是丙酮醛与精氨酸残基的反应。半胱氨酸可在赖氨酸和组氨酸等亲核位点不作随同修饰的情况下就得到修饰。因此，有大量试剂可进行半胱氨酸的修饰。Sigma-Aldrich(http：//www.sigma-aldrich.com)等公司的网站含有具体试剂的信息。

蛋白质中二硫键的选择性还原也很普遍。二硫键可在生物制药热处理中形成和氧化。伍德沃德氏试剂K可用于修饰特定的谷氨酸残基。N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺可用于形成赖氨酸残基和谷氨酸残基的分子内交联。例如：焦碳酸二乙酯是修饰蛋白质组氨酸残基的试剂。组氨酸也可使用4-羟基-2-壬烯醛进行修饰。赖氨酸残基与其他醹-氨基团的反应，例如，有利于肽结合到蛋白/肽的表面或交联处。赖氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附着点，也是蛋白质糖基化的主要修饰位点。蛋白质的蛋氨酸残基可透过碘乙酰胺、溴乙胺、氯胺T等被修饰。

四硝基甲烷和N-乙酰基咪唑可用于酪氨酸残基的修饰。经二酪氨酸形成的交联可透过过氧化氢/铜离子完成。

对色氨酸修饰的最近研究中使用了N-溴代琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝基苄溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巯基)-3H-吲哚(BPNS-粪臭素)。

当蛋白与戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交联用于配制水凝胶时，治疗性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修饰往往可延长循环半衰期。针对免疫治疗的变态反应原化学修饰往往透过氰酸钾的氨基甲酰化实现。

一种肽或变体，其中肽被修饰或含非肽键，优选为本发明的实施例。一般来说，肽和变体(至少含氨基酸残基之间的肽联接)可使用Lukas et al.(Solid-phase peptidesynthesis under continuous-flow conditions.Proc Natl Acad Sci U S A.May 1981；78(5)：2791-2795)中以及该文列出的参考文献所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式进行合成。芴甲氧羰基(Fmoc)团对N-氨基提供临时保护。使用N，N-二甲基甲酰胺中的20％二甲基呱啶中对这种碱高度敏感的保护基团进行重复分裂。由于它们的丁基醚(在丝氨酸苏氨酸和酪氨酸的情况下)、丁基酯(在谷氨酸和天门冬氨酸的情况下)、叔丁氧羰基衍生物(在赖氨酸和组氨酸的情况下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情况下)及4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基衍生物(在精氨酸的情况下)，侧链功能可能会受到保护。只要谷氨酰胺和天冬酰胺为C-末端残基，侧链氨基功能保护所使用的是由4，4′-二甲氧基二苯基团。固相支撑基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，其由三个单体二甲基丙烯酰胺(骨架单体)、双丙烯酰乙烯二胺(交联剂)和N-丙烯酰肌胺酸甲酯(功能剂)构成。使用的肽-树脂联剂为酸敏感的4-羟甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作为其预制对称酸酐衍生物加入，但是天冬酰胺和谷氨酰胺除外，它们使用被逆转的N，N-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的耦合程序而加入。所有的耦合和脱保护反应用茚三酮、硝基苯磺酸或isotin测试程序监测。合成完成后，用浓度为95％含50％清道夫混合物的三氟醋酸，从伴随去除侧链保护基团的树脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，准确的选择依据合成肽的氨基酸组成。此外，固相和液相方法结合使用对肽进行合成是可能的(例如，请参阅Bruckdorfer et al.，2004以及本文引用的参考文献)

三氟乙酸用真空中蒸发、随后用承载粗肽的二乙基乙醚滴定进行去除。用简单萃取程序(水相冻干后，该程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成试剂一般可从Calbiochem-Novabiochem(英国诺丁汉)获得。

纯化可透过以下技术的任何一种或组合方法进行，如：再结晶法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法以及(通常)反相高效液相色谱法(如使用乙腈/水梯度分离)。

可以使用薄层色谱法、电泳特别是毛细管电泳、固相萃取(CSPE)、反相高效液相色谱法、酸解后的氨基酸分析、快原子轰击(FAB)质谱分析以及MALDI和ESI-Q-TOF质谱分析进行肽分析。

另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或肽变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能为，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合物，它们可为单链和/或双链、或多聚核苷酸的原生或稳定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。

对于连接多核苷酸，已经开发出多种方法，尤其是针对DNA，可透过向载体补充可连接性末端等方法进行连接。例如，可向DNA片段加入补充性均聚物轨道，之后DNA片段被插入到载体DNA。然后，透过补充性均聚物尾巴的氢键结合，将载体和DNA片段结合，从而形成重组DNA分子。

含有一个或多个酶切位点的合成接头为DNA片段与载体连接提供了另一种方法。含各种限制性核酸内切酶的合成接头可透过多种管道购得，其中包括从国际生物技术公司(International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，美国)购得。

编码本发明多肽的DNA理想修饰方法是使用Saiki等人所采用的聚合酶链反应方法。(Diagnosis of sickle cell anemia and beta-thalassemia with enzymaticallyamplified DNA and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes.NEngl J Med.1988Sep 1；319(9)：537-41)。此方法可用于将DNA引入合适的载体(例如，透过设计合适的酶切位点)，也可用于本领域已知的其他有用方法修饰DNA。如果使用病毒载体，痘病毒载体或腺病毒载体为优选。

之后，DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能表达于合适的宿主，从而制成含本发明肽或变体的多肽。因此，可根据已知技术使用编码本发明肽或变体的DNA，用本文所述方法适当修饰后，构建表达载体，然后表达载体用于转化合适宿主细胞，从而表达和产生本发明中的多肽。此类技术包括那些公开于，例如，美国专利4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648。

编码含本发明化合物多肽的DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能被加入到其他多种DNA序列，从而引入到合适的宿主中。同伴DNA将取决于宿主的性质、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持为游离体还是要相互结合。

一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体透过标准方法被引入宿主。一般来说，并不是所有的宿主都会被载体转化。因此，有必要选择转化过的宿主细胞。选择方法包括用任何必要的控制元素向表达载体插入一个DNA序列，该序列对转化细胞中的可选择性属性(如抗生素耐药性)进行编码。

另外，有这种选择属性的基因可在另外一个载体上，该载体用来协同转化所需的宿主细胞。

然后，本发明中的重组DNA所转化的宿主细胞在本文中所述本领域技术人员熟悉的合适条件下培养足够长的时间，从而表达之后可回收的肽。

有许多已知的表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(如酵母菌)、丝状真菌(如曲霉菌)、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。该系统可优选为哺乳动物细胞，如来自ATCC细胞生物学库(Cell Biology Collection)中的CHO细胞。

典型的哺乳动物细胞组成型表达载体质粒包括CMV或含一个合适的多聚A尾巴的SV40启动子以及抗性标志物(如新霉素)。一个实例为从Pharmacia公司(Piscataway，新泽西，美国)获得的pSVL。一种可诱导型哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可以从Pharmacia公司获得。有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，一般可从StratageneCloning Systems公司(La Jolla，CA 92037，美国)获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIp)，并插入了酵母可选择性标记物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416质粒为酵母着丝粒质粒(Ycp)。基于CMV启动子的载体(如，来自于Sigma-Aldrich公司)提供了瞬时或稳定的表达、胞浆表达或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同组合物中的N-端或C-端标记。这些融合蛋白可用于检测、纯化及分析重组蛋白。双标融合为检测提供了灵活性。

强劲的人巨细胞病毒(CMV)启动子调控区使得COS细胞中的组成蛋白表达水平高达1mg/L。对于较弱的细胞株，蛋白水平一般低于0.1mg/L。SV40复制原点的出现将导致DNA在SV40复制容纳性COS细胞中高水平复制。例如，CMV载体可包含细菌细胞中的pMB1(pBR322的衍生物)复制原点、细菌中进行氨苄青霉素抗性选育的钙-内酰胺酶基因、hGH polyA和f1的原点。含前胰岛素原引导(PPT)序列的载体可使用抗FLAG抗体、树脂和板引导FLAG融合蛋白分泌到进行纯化的培养基中。其他与各种宿主细胞一起应用的载体和表达系统是本领域熟知众所周知的。

在另一个实施方案中，对本发明的两个或更多的肽或肽变体进行编码，因此，以一个连续顺序(类似于″一串珠子″的构建体)表达。在达到目标，所述肽或肽变体可能透过连接符氨基酸的延伸处(例如LLLLLL)连接或融合一起，也可能它们之间没有任何附加的肽而被连接。这些构建体也可用于癌症治疗，可诱导涉及MHC I和MHC II类分子的免疫应答。

本发明还涉及一种宿主细胞，其以本发明的多核苷酸载体构建转化而来。宿主细胞可为原核细胞，也可为真核细胞。在有些情况下，细菌细胞为优选原核宿主细胞，典型为大肠杆菌株，例如，大肠杆菌菌株DH5(从Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda，MD，美国)获得)和RR1(从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，MD，美国)，ATCC编号31343获得)。首选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选为脊椎动物细胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和结肠癌细胞株中的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可从Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla，CA92037，美国)获得。首选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为ATCC中的CCL61细胞、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3为ATCC中的CRL 1658细胞、猴肾源性COS-1细胞为ATCC中的CRL 1650细胞以及人胚胎肾细胞的293号细胞。首选昆虫细胞为Sf9细胞，可用杆状病毒表达载体转染。有关针对表达选择合适宿主细胞的概要，可从教科书(PaulinaBalbás and Argelia Lorence《Methods in Molecular Biology Recombinant GeneExpression，Reviews and Protocols》Part One，Second Edition，ISBN 978-1-58829-262-9)和本领域技术人员知道的其他文献中查到。

含本发明DNA结构的适当宿主细胞的转化可使用大家熟知的方法完成，通常取决于使用载体的类型。对于原核宿主细胞的转化，可参阅，如：Cohen等人(1972)在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1972，69，2110中以及Sambrook等人(1989)所著《MolecularCloning，A Laboratory Manual》Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY中使用的方法。酵母细胞的转化在Sherman等人(1986)在Methods In Yeast Genetics，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY中有描述。Beggs(1978)Nature275，104-109中所述方法也很有用。对于脊椎动物细胞，转染这些细胞的试剂等，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体配方，可从Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg，MD 20877，美国)获得。电穿孔也可用于转化和/或转染细胞，是本领域用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞大家熟知的方法。

被成功转化的细胞(即含本发明DNA结构的细胞)可用大家熟知的方法(如PCR)进行识别。另外，上清液存在的蛋白可使用抗体进行检测。

应了解，本发明中的某些宿主细胞用于制备本发明中的肽，例如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。但是，其他宿主细胞可能对某些治疗方法有用。例如，抗原提呈细胞(如树突状细胞)可用于表达本发明中的肽，使它们可以加加载相应的MHC分子中。因此，本发明提出了含本发明中核酸或表达载体的一种宿主细胞。

在一个优选实施方案中，宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。2010年4月29日，美国食品和药物管理局(FDA)批准载有含前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重组融合蛋白可用于治疗无症状或症状轻微的转移性HRPC(Sipuleucel-T)(Small EJ，et al.Placebo-controlled phase IIItrial of immunologic therapy withsipuleucel-T(APC8015)in patients with metastatic，asymptomatic hormonerefractory prostate cancer.J Clin Oncol.2006Jul 1；24(19)：3089-94.Rini etal.Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells(provenge)plus bevacizumab in patients with serologicprogression of prostate cancer after definitive local therapy.Cancer.2006Jul1；107(1)：67-74)。

另一方面，本发明提出了一种配制一种肽及其变体的方法，该方法包括培养宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。

在另一个实施方案中，本发明中的肽、核酸或表达载体用于药物中。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹膜内(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选方法为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予50μg至1.5mg，优选为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围在以前的试验中成功使用(Walter et al Nature Medicine 18，1254-1261(2012))。

本发明的另一方面包括一种体外制备启动的T细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动T细胞，其中所述抗原为根据本发明所述的一种肽。优选情况是足够量的抗原与抗原提呈细胞一同使用。

优选情况是，哺乳动物细胞的TAP肽转运载体缺乏或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽转运载体的适合细胞包括T2、RMA-S和果蝇细胞。TAP是与抗原加工相关的转运载体。

人体肽载入的缺陷细胞株T2从属美国菌种保藏中心(ATCC，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852，美国)目录号CRL1992；果蝇细胞株Schneider 2号株从属ATCC目录CRL 19863；小鼠RMA-S细胞株Karre等人描述过。(Ljunggren，H.-G.，andK.Karre.1985.J.Exp.Med.162：1745)。

优选情况是，宿主细胞在转染前基本上不表达MHC I类分子。刺激因子细胞还优选为表达对T细胞共刺激信号起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA3中的任一种分子。大量MHC I类分子和共刺激分子的核酸序列可从GenBank和EMBL数据库中公开获得。

当MHC I类表位用作一种抗原时，T细胞为CD8阳性T细胞。

如果抗原提呈细胞受到转染而表达这种表位，则优选的细胞包括一个表达载体，该载体有能力表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300的肽或变体氨基酸序列。

可使用其他一些方法来体外生成T细胞。例如，自体肿瘤浸润性淋巴细胞可用于生成CTL。Plebanski等人(Induction of peptide-specific primary cytotoxic Tlymphocyte responses from human peripheral blood.Eur J Immunol.1995Jun；25(6)：1783-7)使用自体外周血淋巴细胞(PLB)制备T细胞。另外，也可能用肽或多肽脉冲处理树突状细胞或透过与重组病毒感染而制成自体T细胞。此外，B细胞可用于制备自体T细胞。此外，用肽或多肽脉冲处理或用重组病毒感染的巨噬细胞可用于配制自体T细胞。Walter等人在2003(Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T-cells expanded oncalibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol.2003Nov 15；171(10)：4974-8)中描述了透过使用人工抗原提呈细胞(aAPC)体外启动T细胞，这也是生成作用于所选肽的T细胞的一种合适方法。在本发明中，根据生物素：链霉素生物化学方法透过将预制的MHC：肽复合体耦合到聚苯乙烯颗粒(微球)而生成aAPC。该系统实现了对aAPC上的MHC密度进行精确调节，这使得可以在血液样本中选择地引发高或低亲合力的高效抗原特异性T细胞反应。除了MHC：肽复合体外，aAPC还应携运含共刺激活性的其他蛋白，如耦合至表面的抗-CD28抗体。此外，此类基于aAPC的系统往往需要加入适当的可溶性因子，例如，诸如白细胞介素-12的细胞因子。

也可用同种异体细胞制得T细胞，在WO 97/26328中详细描述了一种方法，以参考文献方式并入本文。例如，除了果蝇细胞和T2细胞，也可用其他细胞来提呈肽，如CHO细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、细菌、酵母、牛痘感染的靶细胞。另外，可使用植物病毒(例如，参阅Porta et al.Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding systemfor the presentation of foreign peptides.Virology.1994Aug1；202(2)：949-55)，其中描述了将豇豆花叶病毒开发为一种提呈外来肽的高产系统。

被启动的T细胞直接针对本发明中的肽，有助于治疗。因此，本发明的另一方面提出了用本发明前述方法制得的启动T细胞。

按上述方法制成的启动T细胞将会有选择性地识别异常表达含SEQ ID NO：1至SEQID NO 300氨基酸序列的多肽。

优选情况是，T细胞透过与其含HLA/肽复合体的TCR相互作用(如，结合)而识别该细胞。T细胞是杀伤患者靶细胞方法中有用的细胞，其靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序列的多肽。此类患者给予有效量的启动T细胞。给予患者的T细胞可能源自该患者，并按上述方法启动(即，它们为自体T细胞)。或者，T细胞不是源自该患者，而是来自另一个人。当然，优选情况是该供体为健康人。发明人使用″健康个人″系指一个人一般状况良好，优选为免疫系统合格，更优选为无任何可很容易测试或检测到的疾病。

根据本发明，CD8-阳性T细胞的体内靶细胞可为肿瘤细胞(有时表达MHC-II类抗原)和/或肿瘤周围的基质细胞(肿瘤细胞)(有时也表达MHC-II类抗原；(Dengjel et al.，2006))。

本发明所述的T细胞可用作治疗性组合物中的活性成分。因此，本发明也提出了一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者上述有效量的T细胞。

发明人所用的″异常表达″的意思还包括，与正常表达水平相比，多肽过度表达，或该基因在源自肿瘤的组织中未表达，但是在该肿瘤中却表达。″过度表达″系指多肽水平至少为正常组织中的1.2倍；优选为至少为正常组织中的2倍，更优选为至少5或10倍。

T细胞可用本领域已知的方法制得(如，上述方法)。

T细胞继转移方案为本领域所熟知的方案。综述可发现于：Gattinoni L，etal.Adoptive immunotherapy for cancer：building on success.Nat RevImmunol.2006May；6(5)：383-93.Review.以及Morgan RA，et al.Cancer regression inpatients after transfer of genetically engineeredlymphocytes.Science.2006Oct6；314(5796)：126-9)。

本发明的任一分子(即肽、核酸、抗体、表达载体、细胞，启动T细胞、T细胞受体或编码核酸)都有益于治疗疾病，其特点在于细胞逃避免疫反应的打击。因此，本发明的任一分子都可用作药剂或用于制造药剂。这种分子可单独使用也可与本发明中的其他分子或已知分子联合使用。

本发明中所述的药剂优选为一种疫苗。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射方式全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。如果核酸体外注入细胞，可能有益于细胞转染，以共同表达免疫刺激细胞因子(如白细胞介素-2)。肽可完全单独给药，也可与免疫刺激佐剂相结合(见下文)、或与免疫刺激细胞因子联合使用、或以适当的输送系统给药(例如脂质体)。该肽也可共轭形成一种合适的载体(如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露)到合适的载体(例如，参见WO 95/18145)。肽也可能被标记，可能是融合蛋白，或可能是杂交分子。在本发明中给出序列的肽预计能刺激CD4或CD8 T细胞。然而，在有CD4 T-辅助细胞的帮助时，CD8 T细胞刺激更加有效。因此，对于刺激CD8 T细胞的MHC-I类表位，一种杂合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD4阳性T细胞的适当表位。CD4-和CD8刺激表位为本领域所熟知、并包括本发明中确定的表位。

一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300中提出的一种肽以及至少另外一种肽，优选为2至50个、更优选为2至25个、再优选为2至20个、最优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个肽。肽可能从一个或多个特定TAA中衍生，并且可能与MHC I类分子结合。

另一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：300中提出的一种肽以及至少另外一种肽，优选为2至50个、更优选为2至25个、再优选为2至20个、最优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个肽。肽可能从一个或多个特定TAA中衍生，并且可能与MHC I类分子结合。

多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。核酸可能为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。这种核酸的设计和引入方法为本领域所熟知。例如，下列文献中有其概述：(Pascolo et al.，Human peripheral blood mononuclearcellstransfected with messenger RNA stimulate antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes in vitro.Cell Mol Life Sci.2005Aug；62(15)：1755-62)。多核苷酸疫苗很容易制备，但这些载体诱导免疫反应的作用模式尚未完全了解。合适的载体和输送系统包括病毒DNA和/或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，是DNA输送所属领域内熟知的系统。也可使用物理输送系统，如透过「基因枪」。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含刺激T细胞进行上述CDR的表位。

本发明的药剂也可能包括一种或多种佐剂。佐剂是那些非特异性地增强或加强免疫反应的物质(例如，透过CD8-阳性T细胞和辅助T(TH)细胞介导的对一种抗原的免疫应答，因此被视为对本发明的药剂有用。适合的佐剂包括(但不仅限于)1018ISS、铝盐、

据报告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可透过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)启动先天(非适应性)免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液和细胞反应，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状细胞的成熟和分化，导致T

其他有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模拟物，如，Poly(I：C)及其衍生物(如：AmpliGen、Hiltonol、多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I：C12U))、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：环磷酰胺、舒尼替单抗、

首选佐剂是抗-CD40、咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、干扰素a、CpG寡核苷酸及衍生物、多聚(I：C)及衍生物、RNA、西地那非和PLG或病毒颗粒的微粒制剂。

本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特、resiquimod和干扰素-α。

本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特和resimiquimod。在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为环磷酰胺、咪喹莫特或resiquimod。更优选的佐剂是Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA50V、Montanide ISA-51、聚-ICLC

此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉注射，也可口服。为此，肽和其他选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多辅料可在从A.Kibbe所著的Handbook of PharmaceuticalExcipients(第3版，2000年，美国医药协会和制药出版社)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/或治疗腺瘤或癌性疾病。例如，EP2112253中有示例制剂。

本发明提出了一种药剂，其用于治疗癌症，特别是HCC和其他恶性肿瘤。

本发明还涉及一种套件，其包括：

(a)一个容器，包含上述溶液或冻干粉形式的药物组合物；

(b)可选的第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；和

(c)可选的(i)溶液使用或(ii)重组和/或冻干制剂使用的说明。

该套件还步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。容器最好是瓶子、西林瓶、注射器或试管，可以为多用途容器。药物组合物最好是冻干的。

本发明中的套件优选包含一种置于合适容器中的冻干制剂以及重组和/或使用说明。适当的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如双室瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。该容器可能由多种材料制成，如玻璃或塑料。试剂盒和/或容器最好有容器或关于容器的说明书，指明重组和/或使用的说明。例如，标签可能表明冻干剂型将重组为上述肽浓度。该标签可进一步表明制剂用于皮下注射。

存放制剂的容器可使用多用途西林瓶，使得可重复给予(例如，2-6次)重组剂型。该套件可进一步包括装有合适稀释剂(如碳酸氢钠溶液)的第二个容器。

稀释液和冻干制剂混合后，重组制剂中的肽终浓度优选为至少0.15mg/mL/肽(＝75μg)，不超过3mg/mL/肽(＝1500μg)。该套件还可包括商业和用户角度来说可取的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂，过滤液、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。

本发明中的套件可能有一个单独的容器，其中包含本发明所述的药物组合物制剂，该制剂可有其他成分(例如，其他化合物或及其药物组合物)，也可无其他成分，或者每种成分都有其不同容器。

优选情况是，本发明的套件包括与本发明的一种制剂，包装后与第二种化合物(如佐剂(例如GM-CSF)、化疗药物、天然产品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物联合使用。该套件的成分可进行预络合或每种成分在给予患者之前可放置于单独的不同容器。该套件的成分可以是一种或多种溶液，优选为水溶液，更优选为无菌水溶液。该套件的成分也可为固体形式，加入合适的溶剂后转换为液体，最好放置于另一个不同的容器中。

治疗套件的容器可能为西林瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛装固体或液体的工具。通常，当成分不只一种时，套件将包含第二个西林瓶或其他容器，使之可以单独定量。该套件还可能包含另一个装载药用液体的容器。优选情况是，治疗套件将包含一个装置(如，一个或多个针头、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本发明的药物(本套件的组合物)。

本发明的药物配方适合以任何可接受的途径进行肽给药，如口服(肠道)、鼻内、眼内、皮下、皮内、肌内，静脉或经皮给药。优选为皮下给药，最优选为皮内给药，也可透过输液泵给药。

由于本发明的肽从HCC中分离而得，因此，本发明的药剂优选用于治疗HCC。

本发明进一步包括为个体患者制备个体化药物的一种方法，其中包括：制造含选自预筛选TUMAP存储库至少一种肽的药物组合物，其中药物组合物中所用的至少一种肽选择为适合于个体患者。在一项实施方案中，药物组合物为一种疫苗。该方法也可以改动以产生下游应用的T细胞克隆物，如：TCR隔离物或可溶性抗体和其他治疗选择。

「个体化药物」系指专门针对个体患者的治疗，将仅用于该等个体患者，包括个体化活性癌症疫苗以及使用自体组织的过继细胞疗法。

如本文所述，″存储库″应指已经接受免疫原性预筛查和/或在特定肿瘤类型中过量提呈的一组肽。″存储库″一词并不暗示，疫苗中包括的特定肽已预先制造并储存于物理设备中，虽然预期有这种可能性。明确预期所述肽可以用于新制造每种个体化疫苗，也可能被预先制造和储存。存储库(例如，数据库形式)由肿瘤相关肽组成，其在各种HLA-A HLA-B和HLA-C等位基因HCC患者的肿瘤组织中高度过度表达。其可能含有包括MHC I类和MHC II类肽或拉长的MHC I类肽。除了从几种HCC组织中采集的肿瘤相关肽外，存储库还可能包含HLA-A＊02和HLA-A＊24标记肽。这些肽可对TUMAP诱导的T细胞免疫进行量化比较，从而可得出疫苗抗肿瘤反应能力的重要结论。其次，在没有观察到来自患者″自身″抗原TUMAP的任何疫苗诱导的T细胞反应时，它们可作为来自″F″非自身″抗原的重要阳性对照肽。第三，它还可对患者的免疫功能状态得出结论。

存储库的TUMAP透过使用一种功能基因组学方法进行鉴定，该方法结合了基因表达分析、质谱法和T细胞免疫学

1.恶性材料的HLA配体用质谱法确定

2.使用全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析法用于确定恶性肿瘤组织(HCC)与一系列正常器官和组织相比过度表达的基因。

3.确定的HLA配体与基因表达数据进行比较。肿瘤组织上过度提呈或选择性提呈的肽，优选为第2步中检测到的选择性表达或过度表达基因所编码的考虑为多肽疫苗的合适候选TUMAP。

4.文献检索以确定更多证据以支持确认为TUMP的肽的相关性

5.过度表达在mRNA水平的相关性由肿瘤组织第3步选定的TUMAP重新检测而确定，并且在健康组织上缺乏(或不经常)检测。

6.为了评估透过选定的肽诱导体内T细胞反应是否可行，使用健康供体以及HCC患者的人T细胞进行体外免疫原性测定。

重要的是要认识到，透过本发明的疫苗引发的免疫应答在不同的细胞阶段和开发的不同阶段攻击癌症。而且不同的癌症相关信号通路被攻击。这相对于其他疫苗的优势，这些疫苗只针对一个或几个靶标，这可能会导致肿瘤很容易适应于攻击(肿瘤逃逸)。此外，并非所有的个体肿瘤都表达相同模式的抗原。因此，几个肿瘤相关肽的组合确保了每个肿瘤都承担至少一些靶标。该组合物以这样特别的方式设计，预期每个HLA-A＊02和/或HLA-A＊24阳性肿瘤可表达几种抗原并覆盖肿瘤生长和维持所需要的几种独立的途径。对于特定于两个HLA I类等位基因(A＊02和A＊24)的每个肽子集，基于基础的实验分析这得到独立的确保。因此，疫苗可易于「现成的」用于较大患者群体。这意味着，预选择接受疫苗治疗的患者可限制为HLA分型，无需抗原表达的任何额外的生物标志物评估，但仍然确保多个靶标同时被诱导的免疫应答攻击，这对于疗效很重要(Banchereau et al.，2001；Walter et al.，2012)。

一方面，在将所述肽加入存储库之前，对其进行筛查以了解免疫原性。举例来说(但不限于此)，纳入存储库的肽的免疫原性的确定方法包括体外T细胞启动，具体为：用装载肽/MHC复合体和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞反复刺激来自健康供体的CD8+ T细胞。

这种方法优选用于罕见癌症以及有罕见表达谱的患者。与含目前开发为固定组分的多肽混合物相反的是，存储库可将肿瘤中抗原的实际表达于疫苗进行更高程度的匹配。在多目标方法中，每名患者将使用几种现成摂肽的选定单一肽或组合。理论上来说，基于从50抗原肽库中选择例如5种不同抗原肽的一种方法可提供大约170万种可能的药物产品(DP)组分。

在一方面，选择所述肽用于疫苗，其基于个体患者的适合性，并使用本发明此处或后文所述的方法。

HLA表型、转录和肽组学资料从患者的肿瘤材料和血液样本中收集，以确定最合适每名患者且含有″存储库″和患者独特(即突变)TUMAP的肽。将选择的那些肽选择性地或过度表达于患者肿瘤中，并且可能的情况下，如果用患者个体PBMC进行检测，则表现出很强的体外免疫原性。

优选的情况是，疫苗所包括的肽的一种确定方法包括：(a)识别由来自个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；(b)将(a)中鉴定的肽与上述肽的存储库(数据库)进行比对；且(c)从与患者中确定的肿瘤相关肽相关的存储库(数据库)中选择至少一种肽。例如，肿瘤样本提呈的TUMAP的鉴定方法有：(a1)将来自肿瘤样本的表达数据与所述肿瘤样本组织类型相对应的正常组织样本的表达数据相比对，以识别肿瘤组织中过度表达或异常表达的蛋白；以及(a2)将表达数据与结合到肿瘤样本中I类MHC和/或II类分子的MHC配体序列想关联，以确定来源于肿瘤过度表达或异常表达的蛋白质的MHC配体。优选情况是，MHC配体的序列的确定方法是：洗脱来自肿瘤样本分离的MHC分子结合肽，并测序洗脱配体。优选情况是，肿瘤样本和正常组织从同一患者获得。

除了使用存储库(数据库)模型选择肽以外，或作为一种替代方法，TUMAP可能在新患者中进行重新鉴定，然后列入疫苗中。作为一种实施例，患者中的候选TUMAP可透过以下方法进行鉴定：(a1)将来自肿瘤样本的表达数据与所述肿瘤样本组织类型相对应的正常组织样本的表达数据相比对，以识别肿瘤组织中过度表达或异常表达的蛋白；以及(a2)将表达数据与结合到肿瘤样本中I类MHC和/或II类分子的MHC配体序列相关联，以确定来源于肿瘤过度表达或异常表达的蛋白质的MHC配体。作为另一实施例，蛋白的鉴定方法为可包含突变，其对于肿瘤样本相对于个体患者的相应正常组织是独特的，并且TUMAP可透过特异性靶向作用于变异来鉴定。例如，肿瘤以及相应正常组织的基因组可透过全基因组测序方法进行测序：为了发现基因蛋白质编码区域的非同义突变，从肿瘤组织中萃取基因组DNA和RNA，从外周血单核细胞(PBMC)中提取正常非突变基因组种系DNA。运用的NGS方法只限于蛋白编码区的重测序(外显子组重测序)。为了这一目的，使用供货商提供的靶序列富集试剂盒来捕获来自人样本的外显子DNA，随后使用HiSeq2000(Illumina公司)进行测序。此外，对肿瘤的mRNA进行测序，以直接定量基因表达，并确认突变基因在患者肿瘤中表达。得到的数以百万计的序列读数透过软件算法处理。输出列表中包含突变和基因表达。肿瘤特异性体突变透过与PBMC衍生的种系变化比较来确定，并进行优化。然后，为了存储库可能测试新确定的肽了解如上所述的免疫原性，并且选择具有合适免疫原性的候选TUMAP用于疫苗。

在一个示范实施方案中，疫苗中所含肽透过以下方法确定：(a)用上述方法识别由来自个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；(b)将(a)中鉴定的肽与进行肿瘤(与相应的正常组织相比)免疫原性和过量提呈预筛查肽的存储库进行比对；(c)从与患者中确定的肿瘤相关肽相关的存储库中选择至少一种肽；及(d)可选地在(a)中选择至少一种新确定的肽，确认其免疫原性。

在一个示范实施方案中，疫苗中所含肽透过以下方法确定：(a)识别由来自个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；以及(b)在(a)中选择至少一种新确定的肽，并确认其免疫原性。

一旦选定了用于个体化肽疫苗的肽时，则产生疫苗。该疫苗优选为一种液体制剂，包括溶解于33％DMSO中的个体肽。

列入产品的每种肽都溶于DMSO中。单个肽溶液浓度的选择取决于要列入产品中的肽的数量。单肽-DMSO溶液均等混合，以实现一种溶液中包含所有的肽，且浓度为每肽～2.5mg/ml。然后该混合溶液按照1∶3比例用注射用水进行稀释，以达到在33％DMSO中每肽0.826mg/ml的浓度。稀释的溶液透过0.22μm无菌筛检程序进行过滤。从而获得最终本体溶液。

最终本体溶液填充到小瓶中，在使用前储存于-20℃下。一个小瓶包含700μL溶液，其中每种肽含有0.578mg。其中的500μL(每种肽约400μg)将用于皮内注射。

下列描述优选方案的实施例将对本发明进行说明(但是不仅限于此)。考虑到本发明的目的，文中引用的所有参考文献透过引用的方式并入在本文中。

在图中，

图1显示了正常组织(暗灰色)和HCC(浅灰色)中各种肽的过量提呈。图1A)APOB，肽：ALVDTLKFV(A＊02)(SEQ ID NO：7)，从左至右的组织；1脂肪组织，3肾上腺，2动脉，2骨髓，7大脑，3乳房，13结肠，4食管，2胆囊，3胃肠道，3心脏，16肾脏，4白细胞样本，45肺，1淋巴结，1卵巢，7胰腺，1周围神经，1脑垂体，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，1浆膜，3皮肤，4脾脏，7胃，1睾丸，2胸腺，3甲状腺2子宫，2静脉，以及20肝脏；图1B)ALDH1L1，肽：KLQAGTVFV(A＊02)(SEQ ID NO：2)，从左至右的组织：1脂肪组织，3肾上腺，2动脉，2骨髓，7大脑，3乳房，13结肠，4食管，2胆囊，3胃肠道，3心脏，16肾脏，4白细胞样本，45肺，1淋巴结，1卵巢，7胰腺，1周围神经，1脑垂体，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，1浆膜，3皮肤，4脾脏，7胃，1睾丸，2胸腺，3甲状腺2子宫，2静脉，以及20肝脏；图1C)C8B，肽：AYLLQPSQF(A＊24)(SEQ IDNO：200)，从左至右的组织：包括2肾上腺，1动脉，4大脑，1乳腺，5结肠，1心脏，13肾脏，9肺，3胰腺，2直肌，3皮肤，1脾脏，12胃，1胸腺，2子宫和9肝脏；图1D)RAD23B肽：KIDEKNFVV(SEQ lDNO：63)，1浆膜，1脂肪组织，3肾上腺，2动脉，2骨髓，7大脑，3乳房，13结肠，2胆囊，3胃肠道，3心脏，12肾脏，4白细胞，19肺，43肺，1淋巴结，1卵巢，6胰腺，1周围神经，1脑垂体，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮肤，4脾脏，5胃，1睾丸，2胸腺，3甲状腺2子宫，2静脉，4食管；图1E)RAD23B，肽：KIDEKNFVV(SEQ ID NO：63)，显示的仅是上面提呈肽的样本：5细胞系，1正常组织(1肾上腺)，16癌组织(2脑癌，4肝癌，5肺癌，1直肠癌，1膀胱癌，3子宫癌)(从左至右)；图1F)RFNG RLPPDTLLQQV(SEQ ID NO：92)，显示的仅是上面提呈肽的样本：1浆膜，1脂肪组织，3肾上腺，2动脉，2骨髓，7大脑，3乳房，13结肠，2胆囊，3胃肠道，3心脏，12肾脏，4白细胞，19肺，43肺，1淋巴结，1卵巢，6胰腺，1周围神经，1脑垂体，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮肤，4脾脏，5胃，1睾丸，2胸腺，3甲状腺2子宫，2静脉，4食管；图1G)RFNG，肽：RLPPDTLLQQV(SEQ ID NO：92)，显示的仅是上面提呈肽的样本：2细胞系，2正常组织(2肾上腺)，17癌组织(1脑癌，1乳房癌，1食道癌，5肝癌，4肺癌，1卵巢癌，1前列腺癌，2膀胱癌，1子宫癌)(从左至右)；图1H)FLVCR1，肽：SVWFGPKEV(SEQ ID NO：104)，1浆膜，1脂肪组织，3肾上腺，2动脉，2骨髓，7大脑，3乳房，13结肠，2胆囊，3胃肠道，3心脏，12肾脏，4白细胞，19肺，43肺，1淋巴结，1卵巢，6胰腺，1周围神经，1脑垂体，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮肤，4脾脏，5胃，1睾丸，2胸腺，3甲状腺2子宫，2静脉，4食管；图1I)FLVCR1，肽：SVVVFGPKEV(SEQID NO：104)，显示的仅是上面提呈肽的样本：9细胞系，1正常组织(1小肠)，16癌组织(1脑癌，1乳腺癌，5肝癌，5肺癌，1皮肤癌，1胃癌，1膀胱癌，1子宫癌)(从左至右)；图1J)IKBKAP，肽：LLFPHPVNQV(SEQ ID NO：156)，1浆膜，1脂肪组织，3肾上腺，2动脉，2骨髓，7大脑，3乳房，13结肠，2胆囊，3胃肠道，3心脏，12肾脏，4白细胞，19肺，43肺，1淋巴结，1卵巢，6胰腺，1周围神经，1脑垂体，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮肤，4脾脏，5胃，1睾丸，2胸腺，3甲状腺2子宫，2静脉，4食管；图1K)IKBKAP，肽：LLFPHPVNQV(SEQ ID NO：156)，显示的仅是上面提呈肽的样本：7细胞系，2原代培养物，1正常组织(1结肠)，34癌组织(1骨髓癌，1乳腺癌，1结肠癌，2食道癌，2白细胞白血病癌症，4肝癌，11肺癌，3淋巴结癌，5卵巢癌，4膀胱癌)(从左至右)；图1L)NKD1，肽：FLDTPIAKV(SEQ ID NO：47)，1浆膜，1脂肪组织，3肾上腺，2动脉，2骨髓，7大脑，3乳房，13结肠，2胆囊，3胃肠道，3心脏，12肾脏，4白细胞，19肺，43肺，1淋巴结，1卵巢，6胰腺，1周围神经，1脑垂体，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮肤，4脾脏，5胃，1睾丸，2胸腺，3甲状腺2子宫，2静脉，4食管；图1M)NKD1，肽：FLDTPIAKV(SEQ ID NO：47)，显示的仅是上面提呈肽的样本：1其他疾病(脑膨出)，2正常组织(1肺，1脾)，35癌组织(5脑癌，6结肠癌，1食道癌，6肝癌，9肺癌，1卵巢癌，1前列腺癌，4直肠癌，2胃癌)(从左至右)。

图2显示了本发明的源基因的代表性表达特征(与正常肾脏相比的相对表达)，这些基因在一系列正常组织(深灰色)HCC中以及12份HCC样本(灰色)中高度过度表达或专门表达。图2A)APOB，从左到右的组织：1肾上腺，1动脉，1骨髓，1脑(全)，1乳腺，1结肠，1食道，1心脏，3肾脏，1白细胞样本，1肝脏，1肺，1淋巴结，1卵巢，1胰腺，1胎盘，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1睾丸，1胸腺，1甲状腺，1膀胱，1子宫颈，1子宫，1静脉；图2B)AMACR，从左到右的组织：1肾上腺，1动脉，1骨髓，1脑(全)，1乳腺，1结肠，1食道，1心脏，3肾脏，1白细胞样本，1肝脏，1肺，1淋巴结，1卵巢，1胰腺，1胎盘，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1睾丸，1胸腺，1甲状腺，1膀胱，1子宫颈，1子宫，1静脉；图2C)ALDH1L1，从左到右的组织：1肾上腺，1动脉，1骨髓，1脑(全)，1乳腺，1结肠，1食道，1心脏，3肾脏，1白细胞样本，1肝脏，1肺，1淋巴结，1卵巢，1胰腺，1胎盘，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1睾丸，1胸腺，1甲状腺，1膀胱，1子宫颈，1子宫，1静脉；图2D)FGG，从左到右的组织：1肾上腺，1动脉，1骨髓，1脑(全)，1乳腺，1结肠，1食道，1心脏，3肾脏，1白细胞样本，1肝脏，1肺，1淋巴结，1卵巢，1胰腺，1胎盘，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1睾丸，1胸腺，1甲状腺，1膀胱，1子宫颈，1子宫，1静脉；图2E)C8B，从左到右的组织：1肾上腺，1动脉，1骨髓，1脑(全)，1乳腺，1结肠，1食道，1心脏，3肾脏，1白细胞样本，1肝脏，1肺，1淋巴结，1卵巢，1胰腺，1胎盘，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1睾丸，1胸腺，1甲状腺，1膀胱，1子宫颈，1子宫，1静脉；和图2F)HSD17B6，从左到右的组织：包括1肾上腺，1动脉，1骨髓，1脑(全)，1乳腺，1结肠，1食道，1心脏，3肾脏，1白细胞样本，1肝脏，1肺，1淋巴结，1卵巢，1胰腺，1胎盘，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1睾丸，1胸腺，1甲状腺，1膀胱，1子宫颈，1子宫，1静脉。

图3显示肽特定多聚体染色后实例性流式细胞仪结果。进一步的解释见实施例4。

图4显示肽特定多聚体染色后实例性流式细胞仪结果。进一步的解释见实施例4。

实施例

实施例1：细胞表面提呈的肿瘤相关肽的识别和定量

组织样本

患者的肿瘤组织获得自

从组织样本中分离HLA肽

根据方案(Falk，K.，1991；Seeger，F.H.T.，1999)略加修改，使用HLA-A＊02-特异性抗体BB7.2、HLA-A、HLA-B、HLA-C特异性抗体W6/32、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理和超滤方法以固体组织的免疫沉淀法获得了激冻组织样本的HLA肽库。

质谱分析

获得的HLA肽库根据其疏水性用反相色谱(nanoAcquity UPLC system，Waters)分离，洗脱肽用装有电喷雾源的LTQ-velos融合杂交质谱(ThermoElectron)进行了分析。肽库被直接加载填充有1.7μm C18反相材料(Waters)的分析用熔炼石英微毛细管柱(75μm内径x250mm)，应用流速为400nL每分钟。随后，使用来自流速为300nL每分钟、浓度为10％至33％溶剂B中的两步180分钟二元梯度法对肽进行分离。梯度由溶剂A(含0.1％甲酸的水)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈)。金镀膜玻璃毛细管(PicoTip，New Objective)用于引入到纳升电喷雾源。使用前5(TOP5)策略在数据依赖模式下操作LTQ-Orbitrap质谱仪。简言之，首先以高精确质量完全扫描在orbitrap开始一个扫描周期(R＝30 000)，之后用先前选定离子的动态排除技术在orbitrap中对5种含量最为丰富的前体离子进行MS/MS扫描(R＝7500)。串联质谱以SEQUEST和另一种手动控制器进行解读。生成的自然肽碎片模式与合成序列相同参考肽的碎片模式进行比较后，确保了被识别的肽序列。

无标记相对LC-MS定量透过离子计数(即透过LC-MS功能提取和分析)来进行(Mueller et al.2007a)。该方法假定肽的LC-MS信号区域与样本中其丰度相关。提取的特征透过充电状态去卷积和保留时间校准进行进一步处理(Mueller et al.2007b；Sturm etal.2008)。最后，所有的LC-MS特征与序列鉴定结果交叉引用，以将不同样本和组织的定量数据与肽呈递特征结合。定量数据根据集中数据以两层方式进行正态化处理，以说明技术和生物学复制变异。因此，每个被识别的肽均可与定量资料相关，从而可得出样本和组织之间的相对定量。此外，对候选肽获得的所有定量数据进行手动检查，以确保数据的一致性，并验证自动化分析的准确度。对于每种肽，计算了提呈图，其显示样本平均提呈量以及复制变化。这些特征使HCC样本与正常组织样本的基线值并列。

示范性过度提呈肽的提呈谱示于图1中。示范性肽的提呈分数见表8。

表8：提呈分数。该表列出了与一系列正常组织相比在肿瘤上非常高度过量提呈(+++)、与一系列正常组织相比在肿瘤上高度过量提呈(++)或与一系列正常组织相比在肿瘤上过量提呈(+)的肽。S＊＝磷酸丝氨酸

实施例2

编码本发明肽的基因的表达谱

与正常细胞相比在肿瘤细胞上一种肽过度提呈或特定提呈足够其在免疫治疗中有效使用，一些肽为肿瘤特异性的，尽管存在其源蛋白也存在于正常组织中。但是，mRNA表达谱增加了免疫治疗目标肽选择中其他级别的安全性。特别是对于具有高安全性风险的治疗选择，诸如亲和力成熟的TCR，理想的目标肽将来源于对该肿瘤独一无二且不出现于正常组织中的蛋白。

RNA来源与制备

手术切除组织标本按如上所述(参见实施例1)在获得每名患者的书面知情同意后提供。手术后立即速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRI试剂(Ambion公司，Darmstadt，德国)之后用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德国)清理从这些样本中制备总RNA；这两种方法都根据制造商的方案进行。

健康人体组织中的总RNA从商业途径获得(Ambion公司，Huntingdon，英国；Clontech公司，海德堡，德国；Stratagene公司，阿姆斯特丹，荷兰；BioChain公司，Hayward，CA，美国)。混合数个人(2至123个人)的RNA，从而使每个人的RNA得到等加权。

所有RNA样本的质量和数量都在Agilent 2100Bioanalyzer分析仪(Agilent公司，Waldbronn，德国)上使用RNA 6000Pico LabChip Kit试剂盒(Agilent公司)进行评估。

微数组实验

所有肿瘤和正常组织的RNA样本都使用Affymetrix Human Genome(HG)U133A或HG-U133 Plus 2.0Affymetrix寡核苷酸芯片(Affymetrix公司，Santa Clara，CA，美国)进行基因表达分析。所有步骤都根据Affymetrix手册进行。简言之，如手册中所述，使用SuperScript RTII(Invitrogen公司)以及oligo-dT-T7引物(MWG Biotech公司，Ebersberg，德国)从5-8μg RNA中合成双链cDNA。用BioArray High Yield RNA TranscriptLabelling Kit(ENZO Diagnostics公司，Farmingdale，NY，美国)进行U133A测定或用GeneChip IVT Labelling Kit(Affymetrix公司)进行U133Plus 2.0测定，之后用链霉亲和素-藻红蛋白和生物素化抗链霉素蛋白抗体(Molecular Probes公司，Leiden，荷兰)进行破碎、杂交和染色，这样完成体外转录。用Agilent 2500A GeneArray Scanner(U133A)或Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000(U133Plus 2.0)对图像进行扫描，用GCOS软件(Affymetrix公司)在所有参数默认设置情况下对数据进行分析。为了实现标准化，使用了Affymetrix公司提供的100种管家基因(housekeeping gene)。相对表达值用软件给定的signal log ratio进行计算，正常肾组织样本的值任意设置为1.0。本发明的代表性源基因在HCC中高度过度表达的表达谱如图2所示。进一步代表性基因的表达分数见表9。

表9：表达分数。该表列出了与一系列正常组织相比在肿瘤上非常高度过度表达(+++)、与一系列正常组织相比在肿瘤上高度过度表达(++)或与一系列正常组织相比在肿瘤上过度表达(+)的基因的肽。

实施例3：与HLA-A＊02和HLA-A＊24结合的UV配体交换/肽

本发明基于T细胞疗法的候选肽进一步测试其MHC结合能力(亲和性)。单个肽-MHC复合体透过UV-配体交换产生，其中，紫外线敏感肽经紫外线照射后裂解，与分析的相关肽交换。只有能够有效地结合并稳定肽接受MHC分子的候选肽才能阻止MHC复合体的解离。为了确定交换反应的产率，将基于稳定MHC复合体轻链(β2m)的检测结果进行ELISA测定。检测总体上按照Rodenko等人描述的方法进行。(Rodenko B，Toebes M，Hadrup SR，van EschWJ，Molenaar AM，Schumacher TN，Ovaa H.Generation of peptide-MHC class Icomplexes through UV-mediated ligand exchange.Nat Protoc.2006；1(3)：1120-32.)。

96孔Maxisorp板(NUNC)在室温下在PBS中以2ug/ml链霉亲和素包被过夜，用4倍洗涤并在37℃下在含封闭缓冲液的2％BSA中封闭1小时。复性的HLA-A＊0201/MLA-001单体作为标准品，涵盖15-500ng/ml的范围。紫外线交换反应的肽-MHC单体在封闭缓冲液中稀释100倍。样本在37℃下孵育1小时，洗涤四次，在37℃下以2ug/ml HRP缀合抗-β2m温育1小时，再次洗涤，并以NH

表10A：MHC-I类结合分数

＜20％＝+；20％-49％＝++；50％-75％＝+++；＞＝75％＝++++

表10B：MHC-I类结合分数

HLA-I类限制肽与HLA-A＊02或HLA-A＊24取决于肽序列的结合根据肽交换产量分类：≥10％＝+；≥20％＝++；≥50＝+++；≥75％＝++++.S＊＝磷酸丝氨酸。

实施例4

MHC-I类提呈肽的体外免疫原性

为了获得关于本发明TUMAP的免疫原性信息，发明人使用体外T细胞扩增分析方法进行了研究，其中该分析方法基于使用装载肽/MHC复合体和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞(aAPC)进行反复刺激。用这种方法，发明人可显示出本发明目前为止22种HLA-A＊0201限制TUMAP具有免疫原性，这表明这些肽为对抗人CD8+前体T细胞的T细胞表位(表11)。

CD8+ T细胞体外启动

为了用载有肽-MHC复合体(pMHC)和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞进行体外刺激，发明人首先从德国曼海姆大学诊所在知情同意后获取健康供体的新鲜HLA-A＊02白细胞清除术后产物，使用CD8微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，Germany)透过积极选择分离出CD8+ T细胞。

PBMC和分离出的CD8+淋巴细胞使用前在T细胞培养基(TCM)中培养，培养基包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，Karlsruhe，德国)并补充10％热灭活人AB血清(PAN-Biotech公司，Aidenbach，德国)、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Cambrex公司，Cologne，德国)，1mM丙酮酸钠(CC Pro公司，Oberdorla，德国)和20μg/ml庆大霉素(Cambrex公司)。在此步骤，2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，Heidelberg，德国)和10U/ml的IL-2(NovartisPharma公司，Nürnberg，德国)也加入TCM。

对于pMHC/抗-CD28涂层珠的生成、T细胞的刺激和读出，使用每刺激条件四个不同pMHC分子以及每个读出条件8个不同的pMHC分子在高度限定的体外系统中进行。

纯化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗体9.3(Jung et al.，1987)使用制造商(Perbio公司，波恩，德国)推荐的N-羟基琥珀酰亚胺生物素进行化学生物素化处理。所用珠为5.6μm的链霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯颗粒(Bangs Labooratories，伊利诺伊州，美国)。

用于阳性和阴性对照刺激物的pMHC分别为A＊0201/MLA-001(从Melan-A/MART-1中修饰制得的肽ELAGIGILTV)和A＊0201/DDX5-001(从DDX5中获得的YLLPAIVHl)。

800.000珠/200μl包裹于含有4x12.5ng不同生物素-pMHC的96孔板、进行洗涤，随后加入体积为200μl的600ng生物素抗-CD28。在37℃下，在含5ng/ml IL-12(PromoCell)的200μl TCM中共培养1x10

HCC肽体外免疫原性

对于受到测试的HLA-I类肽，可透过肽特异性T细胞株的生成证明其体外免疫原性。TUMAP特异性多聚体对本发明的三种肽染色后流式细胞仪检测的典型结果如图3和图4所示，同时也含有相应的阴性对照信息。本发明22种肽的结果汇总于表11A。

表11A：本发明中HLA I类肽的体外免疫原性

申请人对本发明的肽所做的体外免疫原性实验的示例性结果。＜20％＝+；20％-49％＝++：50％-69％＝+++；＞＝70％＝++++

表11B：本发明中其他HLA I类肽的体外免疫原性

申请人对本发明的HLA-A＊24限制肽所做的体外免疫原性实验的示例性结果。提示了体外免疫原性实验的结果。阳性孔和供体(其他可评价)的百分比概括为1-20％＝+；20％-49％＝++；50％-69％＝+++；＞＝70％＝++++

健康HLA-A＊02+供体的肽特异性CD8+ T细胞体外反应的示例性结果(图3)

CD8+ T细胞制备的方法为：使用抗CD28mAb和HLA-A＊02涂层的人工APC分别与IMA-APOB-002(序列号7)肽(A，右图)或lMA-APOB-003(B，右图，序列号1)或IMA-ALDH1L1-001(C，右图，序列号2)合成。经过3个周期的刺激后，用A＊02/APOB-002(A)或A＊02/APOB-003(B)或A＊02/ALDH1L1-001进行2D多聚体染色检测肽反应性细胞。左图(A，B，C)显示不相关A＊02/肽复合体刺激的细胞的对照染色。活单细胞在CD8+淋巴细胞上得到门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的多聚体检测的假阳性事件。提示了特异性多聚体+细胞和CD8+淋巴细胞的频率。

健康HLA-A＊24+供体的肽特异性CD8+ T细胞体外反应的示例性结果(图4)CD8+ T细胞制备的方法为：使用抗CD28 mAb和HLA-A＊24涂层的人工APC分别与IMA-KLHL24-001(序列ID号190)肽(A，右图)或IMA-APOB-006(B，右图，序列ID号218)合成。经过3个周期的刺激后，用A＊24/KLHL24-001(A)或A＊24/APOB-006(B)的2D多聚体染色法对肽反应性细胞进行检测。左图(A和B)显示用不相关A＊24/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞在CD8+淋巴细胞上得到门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的多聚体检测的假阳性事件。提示了特异性多聚体+细胞和CD8+淋巴细胞的频率。

实施例5：肽的合成

所有的肽透过使用Fmoc策略以标准、广为接受的固相肽合成法合成。每个肽的身份和纯度已使用质谱和RP-HPLC分析法确定。用冻干法(三氟乙酸盐)获得白色至类白色的肽，纯度为＞50％。所有的TUMAP优选作为三氟乙酸盐或乙酸盐进行给药，其他盐形式也可以。

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<120> 用于肝细胞癌 (HCC) 和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物

<130> I32728WO

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<150> US62/096,165

<151> 2014-12-23

<150> GB1501017.6

<151> 2015-01-21

<160> 348

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

Ser Leu Trp Ser Val Ala Arg Gly Val

1 5

<210> 103

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 103

Ser Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala

1 5

<210> 104

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 104

Ser Val Trp Phe Gly Pro Lys Glu Val

1 5

<210> 105

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 105

Ser Val Tyr Asp Gly Lys Leu Leu Ile

1 5

<210> 106

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 106

Thr Leu Ala Ala Ile Ile His Gly Ala

1 5

<210> 107

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 107

Thr Leu Gly Gln Phe Tyr Gln Glu Val

1 5

<210> 108

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 108

Thr Leu Leu Lys Lys Ile Ser Glu Ala

1 5

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 109

Thr Leu Tyr Ala Leu Ser His Ala Val

1 5

<210> 110

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 110

Thr Val Gly Gly Ser Glu Ile Leu Phe Glu Val

1 5 10

<210> 111

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 111

Thr Val Met Asp Ile Asp Thr Ser Gly Thr Phe Asn Val

1 5 10

<210> 112

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 112

Val Leu Gly Glu Val Lys Val Gly Val

1 5

<210> 113

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 113

Val Leu Met Asp Lys Leu Val Glu Leu

1 5

<210> 114

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 114

Val Leu Ser Gln Val Tyr Ser Lys Val

1 5

<210> 115

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 115

Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu

1 5 10

<210> 116

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 116

Trp Val Ile Pro Ala Ile Ser Ala Val

1 5

<210> 117

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 117

Tyr Ala Phe Pro Lys Ser Ile Thr Val

1 5

<210> 118

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 118

Tyr Leu Asp Asp Glu Lys Asn Trp Gly Leu

1 5 10

<210> 119

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 119

Tyr Leu Asp Lys Asn Leu Thr Val Ser Val

1 5 10

<210> 120

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 120

Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys Ala

1 5

<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 121

Tyr Leu Ile Thr Gly Asn Leu Glu Lys Leu

1 5 10

<210> 122

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 122

Tyr Leu Ser Gln Ala Ala Asp Gly Ala Lys Val Leu

1 5 10

<210> 123

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 123

Tyr Leu Trp Asp Leu Asp His Gly Phe Ala Gly Val

1 5 10

<210> 124

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 124

Leu Leu Ile Asp Val Val Thr Tyr Leu

1 5

<210> 125

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 125

Ala Leu Tyr Gly Arg Leu Glu Val Val

1 5

<210> 126

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 126

Thr Leu Leu Asp Ser Pro Ile Lys Val

1 5

<210> 127

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 127

Val Leu Ile Gly Ser Asn His Ser Leu

1 5

<210> 128

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 128

Gly Leu Ala Phe Ser Leu Asn Gly Val

1 5

<210> 129

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 129

Ser Gln Ala Asp Val Ile Pro Ala Val

1 5

<210> 130

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 130

Ala Leu Asp Ala Gly Ala Val Tyr Thr Leu

1 5 10

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 131

Ala Leu Asp Ser Gly Ala Phe Gln Ser Val

1 5 10

<210> 132

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 132

Ala Leu His Glu Glu Val Val Gly Val

1 5

<210> 133

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 133

Ala Leu Leu Glu Met Asp Ala Arg Leu

1 5

<210> 134

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 134

Ala Leu Leu Glu Thr Asn Pro Tyr Leu Leu

1 5 10

<210> 135

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 135

Ala Leu Leu Gly Lys Ile Glu Lys Val

1 5

<210> 136

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 136

Ala Leu Leu Asn Gln His Tyr Gln Val

1 5

<210> 137

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 137

Ala Leu Pro Thr Val Leu Val Gly Val

1 5

<210> 138

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 138

Ala Leu Ser Gln Val Thr Leu Leu Leu

1 5

<210> 139

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 139

Ala Leu Ser Ser Lys Pro Ala Glu Val

1 5

<210> 140

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 140

Ala Leu Thr Ser Ile Ser Ala Gly Val

1 5

<210> 141

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 141

Ala Met Gly Glu Lys Ser Phe Ser Val

1 5

<210> 142

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 142

Ala Val Ile Gly Gly Leu Ile Tyr Val

1 5

<210> 143

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 143

Phe Ile Leu Pro Asp Ser Leu Pro Leu Asp Thr Leu

1 5 10

<210> 144

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 144

Phe Ile Gln Leu Ile Thr Gly Val

1 5

<210> 145

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 145

Phe Leu Ile Ala Glu Tyr Phe Glu His Val

1 5 10

<210> 146

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 146

Phe Leu Trp Thr Glu Gln Ala His Thr Val

1 5 10

<210> 147

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 147

Gly Leu Ala Pro Gly Gly Leu Ala Val Val

1 5 10

<210> 148

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 148

Gly Leu Phe Ala Pro Leu Val Phe Leu

1 5

<210> 149

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 149

Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val

1 5 10

<210> 150

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 150

Gly Leu Ser Asn Leu Gly Ile Lys Ser Ile

1 5 10

<210> 151

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 151

His Leu Ala Lys Val Thr Ala Glu Val

1 5

<210> 152

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 152

Lys Leu Asp Asn Asn Leu Asp Ser Val

1 5

<210> 153

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 153

Lys Leu Ile Glu Val Asn Glu Glu Leu

1 5

<210> 154

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 154

Lys Leu Thr Asp His Leu Lys Tyr Val

1 5

<210> 155

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 155

Leu Leu Glu Pro Tyr Lys Pro Pro Ser Ala Gln

1 5 10

<210> 156

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 156

Leu Leu Phe Pro His Pro Val Asn Gln Val

1 5 10

<210> 157

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 157

Gln Leu Leu Pro Asn Leu Arg Ala Val

1 5

<210> 158

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 158

Arg Ile Ile Ser Gly Leu Val Lys Val

1 5

<210> 159

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 159

Arg Leu Phe Pro Asp Gly Ile Val Thr Val

1 5 10

<210> 160

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 160

Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu

1 5

<210> 161

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 161

Arg Leu Leu Asp Glu Gln Phe Ala Val

1 5

<210> 162

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 162

Arg Leu Met Ser Ala Leu Thr Gln Val

1 5

<210> 163

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 163

Arg Leu Thr Glu Ser Val Leu Tyr Leu

1 5

<210> 164

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 164

Arg Met Leu Ile Lys Leu Leu Glu Val

1 5

<210> 165

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 165

Arg Val Ile Glu His Val Glu Gln Val

1 5

<210> 166

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 166

Ser Ile Leu Asp Ile Val Thr Lys Val

1 5

<210> 167

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 167

Ser Leu Ala Glu Ser Ser Phe Asp Val

1 5

<210> 168

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 168

Ser Leu Ala Val Leu Val Pro Ile Val

1 5

<210> 169

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 169

Ser Leu Phe Glu Trp Phe His Pro Leu

1 5

<210> 170

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 170

Ser Leu His Asn Gly Val Ile Gln Leu

1 5

<210> 171

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 171

Ser Leu Ile Pro Ala Val Leu Thr Val

1 5

<210> 172

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 172

Ser Leu Leu Asn Phe Leu Gln His Leu

1 5

<210> 173

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 173

Ser Leu Thr Ser Glu Ile His Phe Leu

1 5

<210> 174

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 174

Thr Leu Ala Glu Leu Gly Ala Val Gln Val

1 5 10

<210> 175

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 175

Thr Leu Phe Glu His Leu Pro His Ile

1 5

<210> 176

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 176

Thr Leu Gly Gln Ile Trp Asp Val

1 5

<210> 177

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 177

Val Leu Asp Glu Pro Tyr Glu Lys Val

1 5

<210> 178

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 178

Tyr Ile Phe Thr Thr Pro Lys Ser Val

1 5

<210> 179

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 179

Tyr Ile His Asn Ile Leu Tyr Glu Val

1 5

<210> 180

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 180

Tyr Leu Gly Pro His Ile Ala Ser Val Thr Leu

1 5 10

<210> 181

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 181

Tyr Leu Leu Glu Lys Phe Val Ala Val

1 5

<210> 182

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 182

Tyr Leu Leu His Phe Pro Met Ala Leu

1 5

<210> 183

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 183

Tyr Leu Tyr Asn Asn Glu Glu Gln Val Gly Leu

1 5 10

<210> 184

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 184

Val Val Leu Asp Gly Gly Gln Ile Val Thr Val

1 5 10

<210> 185

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 185

Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln Ala

1 5 10

<210> 186

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 186

Val Leu Leu Ala Gln Ile Ile Gln Val

1 5

<210> 187

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 187

Ser Tyr Pro Thr Phe Phe Pro Arg Phe

1 5

<210> 188

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 188

Arg Tyr Ser Ala Gly Trp Asp Ala Lys Phe

1 5 10

<210> 189

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 189

Ala Phe Ser Pro Asp Ser His Tyr Leu Leu Phe

1 5 10

<210> 190

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 190

Arg Tyr Asn Glu Lys Cys Phe Lys Leu

1 5

<210> 191

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 191

Lys Tyr Pro Asp Ile Ile Ser Arg Ile

1 5

<210> 192

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 192

Ser Tyr Ile Thr Lys Pro Glu Lys Trp

1 5

<210> 193

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 193

Ile Tyr Pro Gly Ala Phe Val Asp Leu

1 5

<210> 194

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 194

Gln Tyr Ala Ser Arg Phe Val Gln Leu

1 5

<210> 195

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 195

Arg Tyr Ala Pro Pro Pro Ser Phe Ser Glu Phe

1 5 10

<210> 196

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 196

Ala Tyr Leu Lys Trp Ile Ser Gln Ile

1 5

<210> 197

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 197

Arg Trp Pro Lys Lys Ser Ala Glu Phe

1 5

<210> 198

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 198

Leu Tyr Trp Ser His Pro Arg Lys Phe

1 5

<210> 199

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 199

Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe

1 5

<210> 200

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 200

Ala Tyr Leu Leu Gln Pro Ser Gln Phe

1 5

<210> 201

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 201

Ala Tyr Val Asn Thr Phe His Asn Ile

1 5

<210> 202

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 202

Ala Tyr Gly Thr Tyr Arg Ser Asn Phe

1 5

<210> 203

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 203

Tyr Tyr Gly Ile Leu Gln Glu Lys Ile

1 5

<210> 204

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 204

Lys Tyr Arg Leu Thr Tyr Ala Tyr Phe

1 5

<210> 205

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 205

Val Tyr Gly Leu Gln Arg Asn Leu Leu

1 5

<210> 206

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 206

Lys Trp Pro Glu Thr Pro Leu Leu Leu

1 5

<210> 207

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 207

Ile Tyr Leu Glu Arg Phe Pro Ile Phe

1 5

<210> 208

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 208

Ser Tyr Asn Pro Ala Glu Asn Ala Val Leu Leu

1 5 10

<210> 209

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 209

Val Phe His Pro Arg Gln Glu Leu Ile

1 5

<210> 210

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 210

Ala Tyr Pro Ala Ile Arg Tyr Leu Leu

1 5

<210> 211

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 211

Ile Tyr Ile Pro Ser Tyr Phe Asp Phe

1 5

<210> 212

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 212

Val Tyr Gly Asp Val Ile Ser Asn Ile

1 5

<210> 213

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 213

Tyr Tyr Asn Lys Val Ser Thr Val Phe

1 5

<210> 214

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 214

Ile Tyr Val Thr Ser Ile Glu Gln Ile

1 5

<210> 215

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 215

Ile Tyr Thr Gly Asn Ile Ser Ser Phe

1 5

<210> 216

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 216

Ile Tyr Ala Asp Val Gly Glu Glu Phe

1 5

<210> 217

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 217

Asp Tyr Ile Pro Tyr Val Phe Lys Leu

1 5

<210> 218

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 218

Val Tyr Gln Gly Ala Ile Arg Gln Ile

1 5

<210> 219

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 219

Gly Val Met Ala Gly Asp Ile Tyr Ser Val

1 5 10

<210> 220

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 220

Ser Leu Leu Glu Lys Glu Leu Glu Ser Val

1 5 10

<210> 221

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 221

Ala Leu Cys Glu Glu Asn Met Arg Gly Val

1 5 10

<210> 222

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 222

Leu Thr Asp Ile Thr Lys Gly Val

1 5

<210> 223

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 223

Phe Leu Phe Asn Thr Glu Asn Lys Leu Leu Leu

1 5 10

<210> 224

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 224

Ala Leu Ala Ser Val Ile Lys Glu Leu

1 5

<210> 225

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 225

Lys Met Asp Pro Val Ala Tyr Arg Val

1 5

<210> 226

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 226

Ala Val Leu Gly Pro Leu Gly Leu Gln Glu Val

1 5 10

<210> 227

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 227

Ala Leu Leu Lys Val Asn Gln Glu Leu

1 5

<210> 228

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 228

Tyr Leu Ile Thr Ser Val Glu Leu Leu

1 5

<210> 229

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 229

Lys Met Phe Glu Ser Phe Ile Glu Ser Val

1 5 10

<210> 230

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 230

Val Leu Thr Glu Phe Thr Arg Glu Val

1 5

<210> 231

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 231

Arg Leu Phe Asn Asp Pro Val Ala Met Val

1 5 10

<210> 232

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 232

Lys Leu Ala Glu Ile Val Lys Gln Val

1 5

<210> 233

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 233

Ala Leu Leu Gly Lys Leu Asp Ala Ile

1 5

<210> 234

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 234

Tyr Leu Glu Pro Tyr Leu Lys Glu Val

1 5

<210> 235

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 235

Lys Leu Phe Glu Glu Ile Arg Glu Ile

1 5

<210> 236

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 236

Ala Leu Ala Asp Lys Glu Leu Leu Pro Ser Val

1 5 10

<210> 237

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 237

Ala Leu Arg Gly Glu Ile Glu Thr Val

1 5

<210> 238

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 238

Ala Met Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gly Val

1 5 10

<210> 239

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 239

Phe Leu Leu Gly Phe Ile Pro Ala Lys Ala

1 5 10

<210> 240

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 240

Phe Leu Trp Glu Arg Pro Thr Leu Leu Val

1 5 10

<210> 241

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 241

Phe Val Leu Pro Leu Leu Gly Leu His Glu Ala

1 5 10

<210> 242

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 242

Gly Leu Phe Ala Pro Val His Lys Val

1 5

<210> 243

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 243

Gly Leu Leu Asp Asn Pro Glu Leu Arg Val

1 5 10

<210> 244

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 244

Lys Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Val

1 5

<210> 245

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 245

Lys Leu Gly Ala Val Phe Asn Gln Val

1 5

<210> 246

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 246

Lys Leu Ile Ser Ser Tyr Tyr Asn Val

1 5

<210> 247

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 247

Lys Leu Leu Asp Thr Met Val Asp Thr Phe Leu

1 5 10

<210> 248

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 248

Lys Leu Asn Asp Leu Ile Gln Arg Leu

1 5

<210> 249

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 249

Leu Leu Leu Gly Glu Arg Val Ala Leu

1 5

<210> 250

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 250

Asn Leu Ala Glu Val Val Glu Arg Val

1 5

<210> 251

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 251

Arg Leu Phe Ala Asp Ile Leu Asn Asp Val

1 5 10

<210> 252

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 252

Arg Thr Ile Glu Tyr Leu Glu Glu Val

1 5

<210> 253

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 253

Arg Val Pro Pro Pro Pro Gln Ser Val

1 5

<210> 254

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 254

Arg Val Gln Glu Ala Ile Ala Glu Val

1 5

<210> 255

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 255

Ser Leu Phe Gly Gln Asp Val Lys Ala Val

1 5 10

<210> 256

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 256

Ser Leu Phe Gln Gly Val Glu Phe His Tyr Val

1 5 10

<210> 257

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 257

Ser Leu Leu Glu Lys Ala Gly Pro Glu Leu

1 5 10

<210> 258

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 258

Ser Leu Met Gly Pro Val Val His Glu Val

1 5 10

<210> 259

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 259

Thr Leu Ile Thr Asp Gly Met Arg Ser Val

1 5 10

<210> 260

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 260

Thr Leu Met Asp Met Arg Leu Ser Gln Val

1 5 10

<210> 261

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 261

Val Leu Phe Gln Glu Ala Leu Trp His Val

1 5 10

<210> 262

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 262

Val Leu Pro Asn Phe Leu Pro Tyr Asn Val

1 5 10

<210> 263

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 263

Val Leu Tyr Pro Ser Leu Lys Glu Ile

1 5

<210> 264

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 264

Val Met Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln Ser Val

1 5 10

<210> 265

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 265

Trp Leu Ile Glu Asp Gly Lys Val Val Thr Val

1 5 10

<210> 266

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 266

Ser Leu Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu

1 5 10

<210> 267

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 267

Ala Leu Asn Glu Asn Ile Asn Gln Val

1 5

<210> 268

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 268

Lys Leu Tyr Gln Glu Val Glu Ile Ala Ser Val

1 5 10

<210> 269

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 269

Tyr Leu Met Glu Gly Ser Tyr Asn Lys Val

1 5 10

<210> 270

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 270

Ser Val Leu Asp Gln Lys Ile Leu Leu

1 5

<210> 271

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 271

Leu Leu Leu Asp Lys Leu Ile Leu Leu

1 5

<210> 272

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 272

Gln Gln Leu Asp Ser Lys Phe Leu Glu Gln Val

1 5 10

<210> 273

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 273

Ala Ile Leu Glu Thr Ala Pro Lys Glu Val

1 5 10

<210> 274

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 274

Ala Leu Ala Glu Ala Leu Lys Glu Val

1 5

<210> 275

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 275

Ala Leu Ile Glu Gly Ala Gly Ile Leu Leu

1 5 10

<210> 276

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 276

Ala Leu Leu Glu Ala Asp Val Asn Ile Lys Leu

1 5 10

<210> 277

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 277

Ala Leu Leu Glu Glu Asn Ser Thr Pro Gln Leu

1 5 10

<210> 278

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 278

Ala Leu Thr Ser Val Val Val Thr Leu

1 5

<210> 279

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 279

Ala Leu Trp Thr Gly Met His Thr Ile

1 5

<210> 280

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 280

Ala Thr Leu Asn Ile Ile His Ser Val

1 5

<210> 281

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 281

Gly Leu Leu Ala Gly Asp Arg Leu Val Glu Val

1 5 10

<210> 282

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 282

Gly Gln Phe Pro Ser Tyr Leu Glu Thr Val

1 5 10

<210> 283

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 283

Ile Leu Ser Gly Ile Gly Val Ser Gln Val

1 5 10

<210> 284

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 284

Lys Leu Asp Ala Phe Val Glu Gly Val

1 5

<210> 285

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 285

Lys Leu Leu Asp Leu Ser Asp Ser Thr Ser Val

1 5 10

<210> 286

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 286

Lys Val Leu Asp Lys Val Phe Arg Ala

1 5

<210> 287

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 287

Leu Ile Gly Glu Phe Leu Glu Lys Val

1 5

<210> 288

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 288

Leu Leu Asp Asp Ser Leu Val Ser Ile

1 5

<210> 289

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 289

Leu Leu Leu Glu Glu Gly Gly Leu Val Gln Val

1 5 10

<210> 290

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 290

Asn Leu Ile Asp Leu Asp Asp Leu Tyr Val

1 5 10

<210> 291

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 291

Gln Leu Ile Asp Tyr Glu Arg Gln Leu

1 5

<210> 292

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 292

Arg Ile Pro Ala Tyr Phe Val Thr Val

1 5

<210> 293

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 293

Phe Leu Ala Ser Glu Ser Leu Ile Lys Gln Ile

1 5 10

<210> 294

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 294

Arg Leu Ile Asp Leu His Thr Asn Val

1 5

<210> 295

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 295

Ser Leu Phe Ser Ser Pro Pro Glu Ile

1 5

<210> 296

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 296

Ser Leu Leu Ser Gly Arg Ile Ser Thr Leu

1 5 10

<210> 297

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 297

Thr Leu Phe Tyr Ser Leu Arg Glu Val

1 5

<210> 298

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 298

Thr Met Ala Lys Glu Ser Ser Ile Ile Gly Val

1 5 10

<210> 299

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 299

Ala Leu Leu Arg Val Thr Pro Phe Ile

1 5

<210> 300

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 300

Thr Leu Ala Gln Gln Pro Thr Ala Val

1 5

<210> 301

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 301

Val Leu Ala Asp Phe Gly Ala Arg Val

1 5

<210> 302

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 302

Lys Ile Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val

1 5

<210> 303

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 303

Gly Val Tyr Asp Gly Glu Glu His Ser Val

1 5 10

<210> 304

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 304

Ser Leu Ile Asp Gln Phe Phe Gly Val

1 5

<210> 305

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 305

Gly Val Leu Glu Asn Ile Phe Gly Val

1 5

<210> 306

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 306

Lys Leu Val Glu Phe Asp Phe Leu Gly Ala

1 5 10

<210> 307

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 307

Ala Val Val Glu Phe Leu Thr Ser Val

1 5

<210> 308

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 308

Ala Leu Leu Arg Thr Val Val Ser Val

1 5

<210> 309

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 309

Gly Leu Ile Glu Ile Ile Ser Asn Ala

1 5

<210> 310

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 310

Ser Leu Trp Gly Gly Asp Val Val Leu

1 5

<210> 311

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 311

Phe Leu Ile Pro Ile Tyr His Gln Val

1 5

<210> 312

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 312

Arg Leu Gly Ile Lys Pro Glu Ser Val

1 5

<210> 313

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 313

Leu Thr Ala Pro Pro Glu Ala Leu Leu Met Val

1 5 10

<210> 314

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 314

Tyr Leu Ala Pro Phe Leu Arg Asn Val

1 5

<210> 315

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 315

Lys Val Leu Asp Gly Ser Pro Ile Glu Val

1 5 10

<210> 316

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 316

Leu Leu Arg Glu Lys Val Glu Phe Leu

1 5

<210> 317

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 317

Lys Leu Pro Glu Lys Trp Glu Ser Val

1 5

<210> 318

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 318

Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu Lys Ile

1 5

<210> 319

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 319

Lys Leu Phe Asn Glu Phe Ile Gln Leu

1 5

<210> 320

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 320

Gly Leu Ala Asp Asn Thr Val Ile Ala Lys Val

1 5 10

<210> 321

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 321

Gly Val Ile Ala Glu Ile Leu Arg Gly Val

1 5 10

<210> 322

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 322

Ile Leu Tyr Asp Ile Pro Asp Ile Arg Leu

1 5 10

<210> 323

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 323

Lys Ile Ile Asp Glu Asp Gly Leu Leu Asn Leu

1 5 10

<210> 324

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 324

Arg Leu Phe Glu Thr Lys Ile Thr Gln Val

1 5 10

<210> 325

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 325

Arg Leu Ser Glu Ala Ile Val Thr Val

1 5

<210> 326

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 326

Ala Leu Ser Asp Gly Val His Lys Ile

1 5

<210> 327

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 327

Gly Leu Asn Glu Glu Ile Ala Arg Val

1 5

<210> 328

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 328

Arg Leu Glu Glu Asp Asp Gly Asp Val Ala Met

1 5 10

<210> 329

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 329

Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu Leu

1 5

<210> 330

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 330

Ser Met Ser Ala Asp Val Pro Leu Val

1 5

<210> 331

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 331

Ser Leu Leu Ala Gln Asn Thr Ser Trp Leu Leu

1 5 10

<210> 332

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 332

Ala Met Leu Ala Val Leu His Thr Val

1 5

<210> 333

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 333

Gly Leu Ala Glu Asp Ile Asp Lys Gly Glu Val

1 5 10

<210> 334

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 334

Ser Ile Leu Thr Ile Glu Asp Gly Ile Phe Glu Val

1 5 10

<210> 335

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 335

Ser Leu Leu Pro Val Asp Ile Arg Gln Tyr Leu

1 5 10

<210> 336

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 336

Tyr Leu Pro Thr Phe Phe Leu Thr Val

1 5

<210> 337

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 337

Thr Leu Leu Ala Ala Glu Phe Leu Lys Gln Val

1 5 10

<210> 338

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 338

Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr Val Thr Val

1 5 10

<210> 339

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 339

Arg Leu Ile Ser Lys Phe Asp Thr Val

1 5

<210> 340

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 340

Lys Val Phe Asp Glu Val Ile Glu Val

1 5

<210> 341

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 341

Tyr Leu Ala Ile Gly Ile His Glu Leu

1 5

<210> 342

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 342

Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val

1 5

<210> 343

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 343

Leu Leu Leu Pro Asp Tyr Tyr Leu Val

1 5

<210> 344

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 344

Val Tyr Ile Ser Ser Leu Ala Leu Leu

1 5

<210> 345

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 345

Ser Tyr Asn Pro Leu Trp Leu Arg Ile

1 5

<210> 346

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 346

Leu Tyr Gln Ile Leu Gln Gly Ile Val Phe

1 5 10

<210> 347

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 347

Ala Leu Asn Pro Ala Asp Ile Thr Val

1 5

<210> 348

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 348

Ala Tyr Lys Pro Gly Ala Leu Thr Phe

1 5

1