从藜麦中提取抑制白色念珠菌蛋白的方法

摘要

本发明提供一种从藜麦中提取抑制白色念珠菌蛋白的方法，包括以下步骤：将藜麦种子干燥打粉；提取藜麦粗蛋白，加入固体硫酸铵，离心，收集沉淀；适当进行复溶，用生理盐水进行洗脱；收集第二个蛋白峰，直至基线平稳；第二个蛋白峰利用透析袋进行浓缩，浓缩后的蛋白进行浓度和抑制白色念珠菌的检测；培养白色念珠菌至对数生长期，取少量菌液进行离心，收集菌体；利用生理盐水稀释菌体至1麦氏单位；利用牛津杯法进行抑菌活性检测。本发明从藜麦中获得抑菌蛋白，促进藜麦的深加工，利于增加藜麦的经济效益和营养与药用价值。

说明书

技术领域

本发明属于抑菌技术领域，具体涉及一种从藜麦中提取抑制白色念珠菌蛋白的方法。

背景技术

近年来，真菌感染(尤其是侵入性真菌感染)的发病率逐年上升，白色念珠菌是最常见的临床病原体。白色念珠菌是一种存在于人类皮肤、粘膜和肠道中的条件性致病真菌。它可以引起身体表面和深部的白色念珠菌甚至细菌血症。它很容易得癌症，艾滋病和器官。移植后免疫功能严重减弱的患者。随着免疫系统疾病日益普及，器官移植广泛使用，以及滥用抗生素，致病真菌感染引致的疾病危害逐渐增加。全球每年约有4000万人感染念珠菌，其中白色念珠菌是主要的传染病原体，约占念珠菌感染的50％至70％，其中念珠菌症死亡率可达30％以上。目前，只有几十种抗真菌药，而且已经发现的主要药物都具有耐药性。因此，对病原真菌及其耐药性的研究逐渐引起人们的重视。目前，唑类药物(如伏立康唑和氟康唑)是治疗和预防念珠菌感染的首选药物。大量应用唑类药物可以治疗念珠菌感染，同时增加念珠菌尤其是白色念珠菌的耐药性。因此，寻找高效、低毒、安全、有效、不易产生耐药菌株的新药已迫在眉睫。

藜麦因其营养丰富，目前在中国的栽培面积逐年扩大。然而藜麦成熟期遇雨容易发生穗发芽现象，严重影响藜麦的品质和产量，常造成严重的经济损失。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种从藜麦中提取抑制白色念珠菌蛋白的方法，提取的蛋白对白色念珠菌的抑制属于物理作用，因而不产生耐药性。

具体技术方案为：

从藜麦中提取抑制白色念珠菌蛋白的方法，包括以下步骤：

S1.将藜麦种子干燥打粉并用淀粉酶处理除去淀粉；

S2.利用混合溶剂提取藜麦粗蛋白；

S3.所述的粗蛋白加入固体硫酸铵，使其饱和度达到40％，离心，弃沉淀，保留上清液；上清液中加入固体硫酸铵，使其饱和度达到65％，离心，收集沉淀；

S4.处理Sephadex G-75填料，装层析柱，内径2cm，长60cm，装好后利用生理盐水进行平衡柱子，备用；将步骤S3收集的沉淀，适当进行复溶，之后适量上样，用生理盐水进行洗脱；弃去第一个出现的蛋白峰，收集第二个蛋白峰，直至基线平稳；

S5.将步骤S4收集第二个蛋白峰利用透析袋进行浓缩，浓缩后的蛋白进行浓度和抑制白色念珠菌的检测；

S6.培养白色念珠菌至对数生长期，取少量菌液进行离心，收集菌体；利用生理盐水稀释菌体至1麦氏单位后备用；

S7.利用牛津杯法进行进行抑菌活性检测；加入检测蛋白溶液80ul；阳性对照为氟康唑，阴性对照为蛋白提取溶剂。

步骤S2中所述的混合溶剂组成：5mM磷酸钠，10mM氯化钠和1Mm EDTA，pH 7.0；料液体积比1:2，4℃提取1小时，离心，获得粗蛋白。

步骤S2、S3中的离心条件为：4℃，10000转，离心20min。

进一步的，步骤S4中的洗脱条件为：流速1ml/min。

本发明是基于新发现一个重要的抑制藜麦穗发芽的关键蛋白，通过生物信息学手段预测其有抑制白色念珠菌的功能，进而对其进行深入研究，通过生物信息学手段预测其有抑制白色念珠菌的功能。

本发明提供的从藜麦中提取抑制白色念珠菌蛋白的方法，具有以下技术效果：

1.通过简单的溶剂获得粗提液，然后通过一步层析即可获得抑制白色念珠菌蛋白。

2.从藜麦中获得抑菌蛋白，促进藜麦的深加工，利于增加藜麦的经济效益和营养与药用价值。

附图说明

图1-5为实施例的照片。

图1为G75层析图谱，2号峰为活性峰。

图2为蛋白粗提液抑菌效果

图3为蛋白经G75层析后的抑菌效果

图4为该抑菌蛋白的二级结构

图5为该蛋白的三级结构域

具体实施方式

结合实施例说明本发明的具体技术方案。

从藜麦中提取抑制白色念珠菌蛋白的方法，包括以下步骤：

S1.将藜麦种子干燥打粉并用淀粉酶处理除去淀粉；

S2.利用混合溶剂提取藜麦粗蛋白；

所述的混合溶剂组成：5mM磷酸钠，10mM氯化钠和1Mm EDTA，pH 7.0；料液体积比1:2，4℃提取1小时，离心，获得粗蛋白。

S3.所述的粗蛋白加入固体硫酸铵，使其饱和度达到40％，离心，弃沉淀，保留上清液；上清液中加入固体硫酸铵，使其饱和度达到65％，离心，收集沉淀；

S4.处理Sephadex G-75填料，装层析柱，内径2cm，长60cm，装好后利用生理盐水进行平衡柱子，备用；将步骤S3收集的沉淀，适当进行复溶，之后适量上样，用生理盐水进行洗脱；洗脱条件为：流速1ml/min。弃去第一个出现的蛋白峰，收集第二个蛋白峰，直至基线平稳；

S5.将步骤S4收集第二个蛋白峰利用透析袋进行浓缩，浓缩后的蛋白进行浓度和抑制白色念珠菌的检测；

S6.培养白色念珠菌至对数生长期，取少量菌液进行离心，收集菌体；利用生理盐水稀释菌体至1麦氏单位后备用；

S7.利用牛津杯法进行进行抑菌活性检测；加入检测蛋白溶液80ul；阳性对照为氟康唑，阴性对照为蛋白提取溶剂。

步骤S2、S3中的离心条件为：4℃，10000转，离心20min。

如图1所示，标号2为G75层析的活性峰。

如图2所示，标号1为蛋白粗提液(抑菌圈直径16.1mm)，3为稀释一半后的蛋白粗提液(抑菌圈直径10.8mm)。

如图3所示，a为G75层析后的浓缩蛋白液，抑菌圈大小为28.5mm；b为G75层析后的未经浓缩的蛋白液，抑菌圈大小为17.0mm；c为NaCl；d为氟康唑；e为伏立康唑

藜麦中存在抑制白色念珠菌生长的蛋白，分子量约为21KD。

如图4所示，该蛋白拥有多个β-折叠，其中蛋白的核心结构是由10个β-折叠形成的一个β三明治结构，并且从其核心部位由向外延伸出了约3个α-螺旋。

如图5所示，该蛋白由三个结构域构成，结构域I是由10条β折叠形成的β-三明治结构，也是该蛋白的紧密核心。结构域II是从结构域I中延伸出来的几个环构成，并由若干个二硫键来维持其稳定状态。结构域III是由具有两个二硫键的小环组成的。从蛋白质的三级结构来看，该蛋白具有典型的由结构域I和结构域II形成的明显裂缝结构。

该蛋白对白色念珠菌的作用是物理性的渗透，因此不产生念珠菌耐药性。

该蛋白的提取方法简单有效，不需要昂贵的试剂。