一种分枝杆菌检测鉴定的试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及临床微生物检测领域，提供了一种快速检测并鉴定临床样本中分枝杆菌的试剂盒及方法。该试剂盒包含2条通用引物扩增分枝杆菌16S rRNA的可变区序列，1条特异引物屏蔽罗氏菌属细菌16S rRNA的可变区，1条特异引物屏蔽棒状杆菌属细菌的16SrRNA的可变区，1条测序引物测定所扩增的分枝杆菌特异性片段正向区段的序列，亲和素标记的磁珠，测序结果与数据库比对判断种属。应用此试剂盒能检测并鉴定临床样本中分枝杆菌，可用于各类临床样本中疑似分枝杆菌感染的临床诊断。不仅为临床诊疗赢得了宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉，操作方便，特异性强的优点。

说明书

技术领域

本发明属临床微生物检测鉴定技术领域，具体涉及一种分枝杆菌检测鉴定的试剂盒及其检测方法。

背景技术

分枝杆菌属包括结核分枝杆菌复合群(MTB、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等)，麻风分枝杆菌以及非结核分枝杆菌(Non-Tuberculosis Mycobacterium(NTM)。MTB引起的结核病是一种慢性的人兽共患性传染病。根据世界卫生组织的统计，目前全球感染MTB的人口已经超过1/3，每年约有200万人死于结核病。目前NTM包含169种和13个亚种，广泛分布于不同的环境中，从水、土壤、空气、食物、原生动物、植物、动物和人类均有分离得到。作为条件致病菌的分枝杆菌，一般很少引起疾病，但是在一定条件下如支气管扩张、慢性阻塞性肺炎、免疫抑制等病人中会对人体造成严重的伤害。目前已经发现的致病性NTM有100种之多，并呈逐年上升趋势。NTM肺病往往对一线二线抗结核药耐受，常规药物治疗效果欠佳，因此建立快速、有效的NTM检测方法对于提高NTM肺病的诊断及治疗具有重要意义。目前用于结核病诊断的方法有很多,例如使用最广泛的涂片镜检，但其灵敏度较低，尤其是对于肺外结核病,以及HIV病毒合并感染的NTM病，其检测效率更低。分子生物学的发展很大程度上促进了结核病的诊断与药物敏感性分析。荧光定量PCR技术是一种高效的分子生物学技术，广泛应用于医学、微生物学、食品学、动植物学等各个领域。该技术对于MTB的检测同样具有重要意义，已成功用于对包括肺、淋巴结、皮肤、胸腹膜、肝、肾等类型组织中MTB检测，且阳性率远高于传统的抗酸染色法。但荧光定量PCR法需要设计针对特定菌种的特异性引物和探针，只能检测的特定的菌种，检测靶标有限，一定程度上限制了其应用范围。Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便，特别是在短片段DNA的测序分析上具有快速、准确的特点，因此广受研究者青睐，并在很多方面已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药检测。本研究建立了一种快速检测并鉴定临床痰液、肺泡灌洗液、胸腹水等标本中结核以及非结核分枝杆菌的方法---PCR-焦磷酸测序法，该方法利用分枝杆菌属在16S rDNA的相对保守性，通过在保守区设计通用引物对分枝杆菌进行PCR扩增，然后利用测序引物对PCR产物中的可变区进行焦磷酸测序，测序结果与数据库序列进行比对，从而到达对分枝杆菌进行检测和种属鉴定的目的。采用该体系进行临床标本的分枝杆菌快速检测鉴定从得到标本到出鉴定结果只需要4h，一次可以同时鉴定96个标本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可靠准确的检测并鉴定临床样本中分枝杆菌的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种分枝杆菌检测鉴定的试剂盒，其特征在于，它包括：

(1)扩增分枝杆菌16S rRNA可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；

(2)屏蔽罗氏菌属细菌16S rRNA可变区的特异引物：其核苷酸序列如SEQID NO：3所示引物对；

(3)屏蔽棒状杆菌属细菌16S rRNA可变区的特异引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示引物对；

(4)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

(5)亲和素标记的磁珠；

其中，SEQ ID NO：2在其5’端标记生物素；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4在其3’端标记MGB；

上述在一次检测中共同使用。

上述分枝杆菌检测鉴定试剂盒，具体包括如下试剂：

(1)无水乙醇；

(2)20mg/ml溶菌酶；

(3)DNA提取试剂：5％(w/v)g/mL Chelex 100缓冲液，20mg/mL蛋白酶K；

(4)反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：1～4，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μL Hot-start Taq DNA聚合酶；

(5)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；

(6)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。

上述分枝杆菌检测鉴定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

(1)样本前处理；

(2)提取分枝杆菌DNA；

(3)以步骤(2)所得DNA为模板，利用通用及屏蔽引物进行分枝杆菌16S rRNA可变区的PCR扩增；

(4)步骤(3)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；

(5)将步骤(4)得到的纯化的PCR产物进行焦磷酸测序；

(6)测序结果与数据库比对判断种属。

作为优选，所述步骤(3)中所述的PCR扩增体系为：10×buffer 5μL，SEQ ID No：10.06μM，SEQ ID NO：2 0.2μM，SEQ ID NO：3 0.6μM，SEQ ID NO：4 0.6μM，DNA模板0.2ng，dNTPS 0.2mM，Hot-start Taq DNA聚合酶2U，加去离子水至50μL；PCR扩增条件为：95℃3min；94℃15s，62℃15s，68℃30s，45个循环；68℃3min。

本发明的有益效果：本发明的试剂盒利用焦磷酸测序技术测定的分枝杆菌16SrRNA可变区的序列，测序结果与数据库比对判断分枝杆菌种类。应用此试剂盒能快速、高效检测疑似分枝杆菌感染临床样本中的分枝杆菌并进行鉴定，可用于临床疑似分枝杆菌感染疾病的辅助诊断，指导用药，达到快速检测，精准用药的效果。同时应用该试剂盒进行检测具有成本低廉，操作方便，特异性强的优点。本发明方法可以使临床样本中分枝杆菌检测鉴定时间缩短到4小时，远快于传统培养生化检测鉴定方法。

附图说明

图1为1例肺泡灌洗液样本检测结果图，测序结果为阴性。

图2为1例肺泡灌洗液样本检测结果图，测序结果为GATAGGACCACGGGATGCATGTCTTG，与数据库比对判定为结核分枝杆菌；

图3为1例痰液样本检测结果图，测序结果为GATAGGACCTTAGGCGCATGTC,与数据库比对判定为胞内分枝杆菌；

图4为1例胸水样本检测结果图，测序结果为GATAGGACCACTTGGCGCATGCC，与数据库比对判定为堪萨斯分枝杆菌；

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：分枝杆菌检测鉴定的试剂盒的制备方法如下：

(1)灭活试剂：无水乙醇，购于杭州长征化学试剂有限公司。

(2)溶菌酶：20mg/ml，购于上海翊圣生物科技有限公司。

(3)DNA提取试剂：

5％(w/v)g/mL Chelex 100缓冲液：含0.03％(w/v)g/mL SDS(购于杭州荧光泰生物技术有限公司)，1％(v/v)Tween-20(购于美国Sigma公司)，1％(v/v)NP-40(购于美国Sigma公司)，20mg/mL蛋白酶K：(购于Amresco)。

(4)反应液：

PCR Buffer：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶(购于美国Sigma公司)，0.06％(w/v)g/mL BSA(购于美国Sigma公司)，0.1％(v/v)Tween-20(购于美国Sigma公司)，0.06MpH8.9Tricine(购于Merck公司)，特异引物SEQ ID NO：1～4，2mM，MgCl2：购于美国Sigma公司，0.2mM dNTPs：购于上海鼎国生物技术有限公司，2U/μL Taq DNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。

(5)单链纯化试剂：

75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司，0.2M NaOH：购于上海试四赫维化工有限公司，10mM Tris-Acetate(pH 7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司，结合缓冲液：由10mM Tris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司)，2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mMEDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司)组成，退火缓冲液：由20mM Tris-Acetate(pH 7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成。亲和素标记的磁珠(购于GE healthcare Bioscience AB)。

(6)测序试剂：

DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于QIAGEN公司，底物APS和荧光素：购于QIAGEN公司，四种dNTP(dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)：购于QIAGEN公司。

实施例2：分枝杆菌检测鉴定的试剂盒的检测方法。

仪器：Bio-Rad S1000PCR仪，Beckman Microfuge 22R台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGEN PyroMark Q96ID测序仪。

(1)样本前处理(灭活)

(1a)取300μL临床样本中加入700μL无水乙醇，摇晃混匀，室温静置30分钟；

(1b)吸取1mL灭活后的临床样本至1.5mL灭菌离心管中，13000rpm离心2min，去上清；

(1c)在沉淀中加入1mL生理盐水，震荡混匀，13000rpm离心2min，去上清；

(1d)重复步骤(1c)一次。

(2)

提取分枝杆菌DNA，具体包括如下步骤：

(2a)在(1)所获得的沉淀中加入5％(w/v)g/mL Chelex 100缓冲液200μL和蛋

白酶K2μL(20mg/mL，)，56℃孵育60min，煮沸15min。

(2b)13000rpm离心2分钟，取上清5μL作为DNA模板备用。

(3)以步骤(2)所得DNA为模板，利用通用引物和屏蔽引物进行分枝杆菌16S rRNA

可变区的PCR扩增；其中，所述的PCR扩增体系为：10×buffer 5μL，SEQ ID No：10.06μM，SEQ ID NO：2 0.2μM，SEQ ID NO：3 0.6μM，SEQ ID NO：4 0.6μM，DNA模板0.2ng，dNTPS 0.2mM，Hot-start Taq DNA聚合酶2U，加去离子水至50μL；PCR扩增条件为：95℃3min；94℃15s，62℃15s，68℃30s，45个循环；68℃3min。

(4)步骤(3)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：

·在使用前，保证所有溶液都达到室温；

·在PSQ 96板中加入45μl annealing buffer，然后每孔加入SEQ ID NO：5测序引物(10uM)1uL；

·使用Vertex混匀Sepharose beads，将需要使用的sepharoe beads总量(每样本3μL)转移到一个Eppendorf管中，在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μL的体积，将混合物混匀；

·将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中，每样本50μL，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合；

·在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；

·打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒，然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads，将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuumpreptool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads；使用高纯水清洗vacuum preptool。

·将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。

(5)将步骤(4)得到的纯化的PCR产物进行焦磷酸测序；

(6)测序结果与美国国家生物信息技术中心(NCBI)数据库比对判断种属。

将本发明方法用于4例不同临床标本的分枝杆菌检测鉴定，测序图如图1-4所示。本发明方法与各标本经微生物培养、致病菌分纯后用法国生物梅里埃的微生物鉴定系统做比对，结果一致。