一种牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的同时鉴定方法及其试剂盒

摘要

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的同时鉴定方法及其试剂盒。本发明利用人结核分枝杆菌和牛分枝杆菌之间的基因组差异，设计1条上游引物和2条不同的下游引物(下游引物分别针对牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌)，根据扩增的靶片段分别设计Taqman探针，并对两条探针进行不同的荧光标记，实现了在同一反应管中同时检测牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌，并通过不同的荧光通道加以鉴别，扩增的同时可以直接在软件上判读结果，而不用跑电泳，避免了气溶胶污染，在临床上有更大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的同时鉴定方法及其试剂盒。 

技术背景

结核病是一种人和多种动物共患的慢性传染病。据WHO报导，全世界有2000万结核病人，每年有800～1000万的新增病例，而我国目前结核病人在600万左右，每年新增病例100～130万。结核病已经成为21世纪严重危机人类健康的疾病之一。自然界中存在着多种人结核分枝杆菌：人结核(或人型)分枝杆菌、牛分枝杆菌(或牛型)等其它人结核分枝杆菌。牛型人结核分枝杆菌不仅可以使牛发病，还可以侵害人和多种动物，奶牛是传播结核病给人类的最危险的动物，而且奶牛的结核患病率较高，与病牛长期接触，或不慎饮用含有人结核分枝杆菌的牛奶都有可能感染结核病，特别是在我国的一部分地区还有喝生奶的习惯，导致感染结核病的几率大大增加。牛人结核分枝杆菌的疗法与结核病疗法的不同点在于牛人结核分枝杆菌天生对抗结核标准药物之一的吡嗪酰胺耐药。有文献指出，在我国的结核病病人中有5％～10％的结核病是由牛分枝杆菌引起，因此，对于人结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别检测显得至关重要。 

目前，临床上对人结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的区别鉴定需要对菌株进行纯培养，同时采用生化方法鉴别，但是人结核分枝杆菌及牛分枝杆菌难以培养，即使培养成功所需时间也在8周左右，并且这些鉴别方法并不可靠，因此迫切需要研发一种快速鉴别检测方法。PCR检测在众多方法中尤显特异性强、敏感性高的特点，近几年来也大量的应用在了牛人结核分枝杆菌的鉴定上，但由于需对扩增产物开管进行电泳会产生大量的气溶胶，导致该方法产生大量的假阳性，所以在临床上没有得到进一步的应用。而荧光实时定量PCR则能为我们提供一种既快速又能有效避免气溶胶的方法。 

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术(HIGUCHIR，FOCKLERC，DOLLINGER G，et al.Kinetic PCR analysis：real-time monitoring of DNA amplification reactions[J].Biotechnology，1993，11：1026；韩俊英，曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用[J].国外医学遗传学分册，2000，23(3)：177.，在此全文引用作为参考，如同全 文叙述一样)。 

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎类病毒、人结核分枝杆菌、细小病毒B19、EB病毒和人巨细胞病毒等多种病原体进行测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。 

本发明利用人结核分枝杆菌和牛分枝杆菌之间的基因组差异，设计1条上游引物和2条不同的下游引物(下游引物分别针对牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌)，根据扩增的靶片段分别设计Taqman探针，并对两条探针进行不同的荧光标记，实现了在同一反应管中同时检测牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌，并通过不同的荧光通道加以鉴别，扩增的同时可以直接在软件上判读结果，而不用跑电泳，避免了气溶胶污染，在临床上有更大的应用前景。 

发明内容

针对现有技术中牛分枝杆菌与人结核分枝杆菌检测需时间长和鉴别困难，及普通PCR容易造成气溶胶污染的缺点，本发明提供了一种牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的同时快速鉴定方法及其试剂盒。 

具体的，本发明提供的一种同时鉴定牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的方法，包括采用如下引物及Taqman探针进行实时荧光定量PCR检测：5’-AGCGCAACACTCTTGGAG-3’为鉴别牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的共用上游引物；人结核分枝杆菌下游引物为5’-GCTCGACATGCTGAATGC-3’；人结核分枝杆菌Taqman探针序列为5’-CGAGTCGCCGTGGCTTCTCTT-3’；牛分枝杆菌下游引物为5’-CCCGTAGCGTTACTGAGAAA-3’；牛分枝杆菌Taqman探针序列为5’-TTGACCAGCTAAGATATC CGGTACGCC-3’。 

优选的，人结核分枝杆菌Taqman探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团；牛分枝杆菌Taqman探针5’端标记JOE荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。 

本发明进一步提供用于上述方法的试剂盒，试剂盒包含如下引物及Taqman探针：5’-AGCGCAACACTCTTGGAG-3’为鉴别牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的共用上游引物；人结核分枝杆菌下游引物为5’-GCTCGACATGCTGAATGC-3’；人结核分枝杆菌Taqman探针序列为5’-CGAGTCGCCGTGGCTTCTCTT-3’；牛分枝杆菌下游引物为5’-CCCGTAGCGTTACTGAGAAA-3’；牛分枝杆菌Taqman探针序列为5’-TTGACCAGCTAAGATATC CGGTACGCC-3’。 

本发明进一步提供上述方法及试剂盒在细菌纯培养物和临床样本直接检测方面的应用。 

有益效果：本发明利用人结核分枝杆菌和牛分枝杆菌之间的基因组差异，设计1条上游引物和2条不同的下游引物(下游引物分别针对牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌)，根据扩增的靶片段分别设计Taqman探针，并对两条探针进行不同的荧光标记，实现了在同一反应管中同时检测牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌，并通过不同的荧光通道加以鉴别，扩增的同时可以直接在软件上判读结果，而不用跑电泳，避免了气溶胶污染，在临床上有更大的应用前景。 

附图说明

图1引物探针设计示意图 

图2Taqman探针技术工作原理示意图 

图3实时定量PCR扩增曲线 

图4针对牛分枝杆菌模板的扩增曲线 

图5针对人结核分枝杆菌模板的扩增曲线 

图6针对牛分枝杆菌模板和人结核分枝杆菌模板两种混合模板的扩增曲线 

图7牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组DNA稀释后扩增曲线 

具体实施方式

本发明提供一种快速鉴别牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的方法。根据牛分枝杆菌和结核基因组的差异，设计一条上游引物和两条下游引物，上游引物为共用引物，下游引物分别针对牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌，设计两条Taqman探针分别针对牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌，牛分枝杆菌的探针5’端标记JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)荧光基团，3’端标记BHQ(Black hole quenchers)淬灭基团，人结核分枝杆菌的探针5’端标记FAM(6-羧基荧光素)荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。当样品中只存在人结核分枝杆菌DNA时，反应体系中的人结核分枝杆菌体系会进行扩增，在FAM通道有荧光信号出现，并有实时扩增曲线；当样品中只存在牛分枝杆菌DNA时，反应体系中牛分枝杆菌体系会进行扩增，在JOE通道有荧光信号出现，并有实时扩增曲线；当同时存在两种菌的DNA时，两个体系会同时工作(浓度比在1∶102以内)，在两个通道都会出现实时扩增曲线，从而实现对两者的鉴别。 

如果是单通道实时荧光PCR仪可分管操作，两个探针5’端均标记FAM荧光基团。 

本发明所提供的引物序列如下：上游引物F1为5’-AGCGCAACACTCTTGGAG-3’(SEQ ID NO：1)，为共用引物。人结核分枝杆菌下游引物R1为5’-GCTCGACATGCTGAATGC-3’(SEQ ID NO：2)，人结核分枝杆菌特异性探针P1序列为5’-CGAGTCGCCGTGGCTTCTCTT-3’(SEQ ID NO： 3)；牛分枝杆菌下游引物R2为5’-CCCGTAGCGTTACTGAGAAA-3’(SEQ ID NO：4)，牛分枝杆菌探针序列P2为5’-TTGACCAGCTAAGATATCCGGTACGCC-3’(SEQ ID NO：5)。 

反应体系为：模板5μl，10×Taq酶buffer 5μl，2.5mM dNTP 4μl，F1引物2μl(浓度为20pmol)，R1引物1μl(浓度为20pmol)，R2引物1μl(浓度为20pmol)，P1探针1μl(浓度为20pmol)，P2探针1μl(浓度为20pmol)，Taq酶2.5U，ddH₂O补至50μl。 

PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃40s，共40个循环；在荧光定量PCR仪上进行扩增，对FAM和JOE通道进行信号收集。 

下述实验例中所用方法及试剂如无特殊说明均为常规方法，所合成的引物探针工作均由上海生工合成。 

1、引物探针的设计与合成 

根据Pub-Med基因库中所提供的牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的基因组序列进行比对，发现牛分枝杆菌与人结核分枝杆菌基因组在核苷酸水平上同源性可以达到99.95％，但牛分枝杆菌的基因组较人结核分枝杆菌的基因组小，存在着大量缺失，其中最大的一个缺失为RD4，大约在12.7Kb，我们主要针对这段缺失设计引物探针。 

如图1所示，红色区域为牛分枝杆菌较人结核分枝杆菌缺失的12.7kb的片段，根据此缺失，设计上游引物F1为共用引物，与牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌均可以结合，在牛分枝杆菌缺失片段上设计下游引物R1及探针P1，这样保证了人结核分枝杆菌的扩增体系不会和牛分枝杆菌进行扩增反应；牛分枝杆菌的探针P2及下游引物R2，虽然都可以与人结核分枝杆菌进行结合，但由于和上游引物相差较远(间隔＞12.7kb)，不能形成扩增，这样也保证了牛分枝杆菌的扩增体系不会和人结核分枝杆菌进行反应。 

所有引物探针的合成和标记都由上海生工来完成。 

2、工作原理 

TaqMan荧光探针的工作原理为：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’～3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离(如图2)，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，形成扩增曲线(如图3)。 

基于以上所述，荧光定量PCR可以避免气溶胶污染，进行多重反应。 

牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的区分依赖于各自特异性探针上标记的荧光集团不同，可 以采用不同的通道对荧光信号进行收集。当模板DNA中只存在人结核分枝杆菌时，只有FAM通道可以收到荧光信号，形成扩增曲线；相反，当模板中只存在牛分枝杆菌时，只有JOE通道可以收集到荧光信号，形成扩增曲线；当两种模板都存在时，两个通道都会收到荧光信号，形成扩增曲线。通过在不同通道的荧光信号观察到的荧光曲线来判断模板中是牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌。 

实施例 

实验材料：牛分枝杆菌(AF2122/97)，人结核分枝杆菌(H₃₇R_V)，Taq酶套装(Takara)，引物F1，R1，R2，探针P1，P2，ddH₂O 

实验仪器：ABI 7500(荧光PCR仪) 

实验方法： 

整个反应体系如表1： 

  序号   组份   初浓度   数量   序号   组份   初浓度   数量   1   超纯水   /   29.5μl   8   Taq酶   5U/L   0.5μl   2   10×buffer   /   5μl   9   dNTP   25mM   4μl   3   PrimerF1   10μM   2μl   10   模板    5μl   4   primer R1   10μM   1μl   11   Total    50μl   5   primer R2   10μM   1μl   12      6   ProbeP1   10μM   1μl   13      7   ProbeP2   10μM   1μl   14    

设三种处理：模板A为牛分枝杆菌纯培养物灭活后提取的核酸；模板B为人结核分枝杆菌纯培养物灭活后提取的核酸；模板C为两者混合物。 

按照上述反应体系进行配置，在ABI7500PCR仪上进行扩增，PCR的反应条件如下：94℃5min；94℃30s，60℃40s，共40个循环；对FAM和JOE通道进行信号收集(如单通道仪器可分管操作，两个探针均标记FAM)。 

图4、5、6分别是针对模板A、B、C的扩增曲线。 

从图4中可以看出，在模板中只含有牛分枝杆菌基因组DNA时，只在对应牛分枝杆菌的通道有扩增曲线，而针对人结核分枝杆菌的通道没有扩增曲线出现。 

从图5中可以看出，在模板中只含有人结核分枝杆菌基因组DNA时，只在对应人结核分枝杆菌的通道有扩增曲线，而针对牛分枝杆菌的通道没有扩增曲线出现。 

从图6中可以看出，在模板中同时含有牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组DNA时，在 两个通道都可以检测到荧光信号。 

从上面图4、5、6可以看出，两种体系在同一反应管中可以很好的进行工作，没有交叉反应，特异性很好。 

鉴于双重PCR可能会发生的干扰现象，对牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的基因组DNA进行梯度稀释，稀释成四个梯度，分别加入到反应体系中，看扩增效果如何，结果如图7。图中A、B为人结核分枝杆菌DNA稀释形成的扩增曲线及标准曲线图，可见双重PCR反应引入的引物探针并不影响其工作；C、D为牛分枝杆菌DNA稀释形成的扩增曲线及标准曲线图，可见双重PCR反应引入的引物探针并不影响其工作。 

由于两个反应共用一条上游引物，并且双重PCR反应中存在的原料共用情况，可能使反应过程中存在竞争关系，故设计实验进行论证两种模板同时存在的情况下，整个体系的工作情况。实验材料同上，扩增体系同上，模板发生了变化，将牛分枝杆菌基因组DNA稀释成4个梯度，分别为1、2、3、4，将人结核分枝杆菌基因组DNA稀释成4个梯度，分别为A、B、C、D，然后将模板进行混合，形成A(1-4)(即梯度A分别与梯度1-4混合，下同)，B(1-4)，C(1-4)，D(1-4)组合，进行扩增实验，结果如表2： 

表2两种不同浓度模板混合存在下体系工作情况 

  序号  FAM通道Ct值  JOE通道Ct值   序号  FAM通道Ct值  JOE通道Ct值   A1  27.31  27.79   C1  33.83  30.62   A2  27.25  30.85   C2  33.77  33.99   A3  27.37  38.02   C3  34.22  37.82   A4  27.29  ND   C4  ND  27.45   B1  30.61  27.53   D1  ND  27.66   B2  30.77  30.98   D2  ND  30.57   B3  30.73  34.34   D3  37.42  33.34   B4  30.64  ND   D4  36.60  37.02

从表中可以看出：当两者浓度相差在10²之内时，二者不会产生明显的干扰；但当浓度差达到10³时，可能由于对共有引物和原料的竞争使得浓度低的一方扩增受到抑制。

结论：经过一系列实验验证，该体系能够有效的将牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌加以区别，分离株样本需2h左右，临床样本3～4h即可完成检测；扩增与检测同时完成，避免了气溶胶污染，在临床上有很大的应用价值。 

序列表