一种快速测定豆类及豆制品中的多组分真菌毒素的方法

摘要

本发明公开一种快速测定豆类及豆制品中的多组分真菌毒素的方法，该方法的步骤为先按比重分别配制提取剂和净化剂A和净化剂B，然后将试样采用提取剂和净化剂A、净化剂B进行处理后采用UPLC‑MS/MS对其多组分的真菌毒素进行定性定量分析。本发明通过采用实验室成本较低的化学剂来配制提取剂和净化剂，并对提取剂和净化剂的配比进行了优化，配制的提取剂及净化剂能够对复杂的样品基质进行更好的净化处理，以去除样品分析干扰成分，提高测量的准确度和精度，操作时间短，且提取净化效果高，结合本发明的UPLC‑MS/MS测定技术，可以在15min内即可完成对AFTB1、OTA、T‑2、HT‑2、ST、FB1、ZEN、NIV、DON、3‑AcDON和15‑AcDON等多组分的真菌毒素进行定量分析，测定效率高且定量灵敏，误差小。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域,具体涉及一种快速测定豆类及豆制品中的多组分真菌毒素的方法。

背景技术

真菌毒素是产毒真菌在适宜环境下代谢产生的有毒物质，真菌毒素能够污染谷物、豆类、水果和蔬菜等植源性农产品，从而通过食物链富集作用，对人类健康和畜禽养殖安全产生严重威胁，真菌毒素污染被WHO和FAO视为食源性疾病的祸首。

近年来，由于真菌毒素样品分析技术的快速发展，在实际分析检测过程中常由于真菌毒素样品分析方法(UPLC法、HPLC-柱前/柱后衍生法、ELISA法、TLC法、胶体金定量检测法、免疫亲和柱-荧光光度法等)、样品前处理技术(溶剂提取、液-液萃取、SPE技术等)、样品种类(谷物、豆类、水果、蔬菜、海产品等)的复杂性和多样性，使得真菌毒素多组分的分析方法存在耗时长、专一性差、回收率低、操作复杂、检测效率低、定量定性不准确等问题。

尤其是豆类作物在生长和贮存过程中，经常会被多种不同的真菌毒素污染，一种真菌也会产生多种毒素，这使得真菌毒素污染具有组分复杂、污染范围广、种类多、样本量大的特点。目前，我国未有专门针对豆类及其制品中真菌毒素多组分分析测定的国家标准方法。现有真菌毒素国家标准分析方法也主要是对谷物、水果、蔬菜和饲料等进行分析，而豆类及其制品往往由于样本基质的特殊性：如黄豆常含有大量蛋白和复杂性：如豆腐乳中往往有几十种添加香料，使用上述的分析方法：UPLC法、HPLC-柱前/柱后衍生法、ELISA法、TLC法、胶体金定量检测法、免疫亲和柱-荧光光度法均无法满足豆类及其制品真菌毒素多组分的分析，且这些方法对真菌毒素多组分分析都存在各自缺点：如UPLC和HPLC由于检测器的限制，在对某些真菌毒素进行分析时，需要进行衍生化处理，从而增加了分析成本和时间；而ELISA法、胶体金定量检测法和免疫亲和柱-荧光光度法等由于受其抗原-抗体特异性限制，只能对单一或几种真菌毒素组分进行分析，无法对真菌毒素多组分进行同时分析，且分析时需要专门的分析试剂盒，成本较高，其定量准确性也较差。

发明内容

因此基于以上背景，本发明提供一种快速测定豆类及豆制品中的多组分真菌毒素的方法，其能够在短时间内对豆类及其制品真菌毒素多组分进行同时分析，耗时短，且测定成本低。

本发明采用的技术方案为：

一种快速测定豆类及豆制品中真菌毒素多组分的方法，该方法的步骤如下：

(1)先按照体积比为1-10％量取甲酸乙腈溶液，再按照体积比为30-50％量取超纯水来配制甲酸乙腈-水溶液提取液；按照质量比为4:4:1称取Na2SO4、NaCl、柠檬酸钠并将其进行混合配制成净化剂A组分；按照质量比为3:2:1来称取MgSO4、PSA、C18并将其进行混合配制成净化剂B组分；

(2)称取一定量粉碎后的待测样品放置于离心管中，加入超纯水和提取剂后，再加入净化剂A组分用混合器混匀一段时间后，用超声波提取仪提取一段时间，以8000-12000转/分钟冷冻离心一段时间；

(3)将步骤(2)冷冻离心后的试样上清液转移至另一离心管中，然后在上清液中加入净化剂B组分，用混合器混匀一段时间后，以8000-12000转/分钟冷冻离心一段时间；

(4)将步骤(3)冷冻离心后的试样上清液用0.22μm有机滤膜进行过滤后，进行分析备用；

(5)将步骤(4)处理后的待分析样采用超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC-MS/MS)对其真菌毒素多组分进行定性定量分析。

改进地，步骤(5)所测定的真菌毒素包括AFTB1、OTA、T-2、HT-2、ST、FB1和ZEN、NIV、DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON。

改进地，所述AFTB1、OTA、T-2、HT-2、ST和FB1的毒素采用ESI+模式分析，所述ZEN、NIV、DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON的毒素采用ESI-模式分析。

改进地，步骤(3)中的UPLC-MS/MS的液相色谱柱为包括但不限于C

改进地，所述步骤(2)和步骤(3)的混合器为涡旋混合器。

改进地，步骤(2)中的待测样品包括但不限于黄豆、绿豆、菜豆、小豆、芸豆、豌豆、豆腐、豆腐乳。

本发明的有益效果为：

本发明的方法能够同时对豆类及豆类制品中的真菌毒素多组分进行测定，该方法耗时短、成本低、实用性强。本发明通过采用实验室成本较低的化学剂来配制提取剂和净化剂，并对提取剂和净化剂的配比进行了优化，配制的提取剂及净化剂能够对复杂的样品基质进行更好的净化处理，以去除样品分析干扰成分，提高测定的准确度和精度，且配制的提取剂及净化剂的不仅成本低，且操作时间短，净化效果好；其结合本发明的UPLC-MS/MS测定技术，可以在15min内即可完成对AFTB1、OTA、T-2、HT-2、ST、FB1、ZEN、NIV、DON、3-AcDON和15-AcDON等真菌毒素多组分定量分析，其测定效率高且定量灵敏，误差小。

附图说明

图1为本发明实施例中实验考察6种真菌毒素总离子流图，其中图1(1)为负离子化合物总离子流图；图1(2)为正离子化合物总离子流图；

图2为本发明实施例中6种真菌毒素色谱图；

图3为本发明实施例中空白样本中6种真菌毒素的加标定量离子色谱图；

图4(1)为本发明实施例中四种负离子化合物真菌毒素溶剂标准曲线；图4(2)为本发明实施例中两种正离子化合物真菌毒素溶剂标准曲线；

图5为本发明实施例中不同提取试剂对6种真菌毒素的提取效率；

图6为本发明实施例中不同提取方式和提取时间对6种真菌毒素的提取效率；

图7为净化剂A不同成分用量对6种真菌毒素回收率的影响，其中图7(1)为本发明实施例中Na

图8为净化剂B不同成分用量对6种真菌毒素回收率的影响，其中图8(1)为本发明实施例中MgSO4用量对回收率的影响；图8(2)为本发明实施例中PSA用量对回收率的影响；图8(3)为本发明实施例中C

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明:

实施例1：一种快速测定豆类及豆制品中的多组分真菌毒素的方法，其步骤如下：

(1)先按照体积比为1-10％量取甲酸乙腈溶液，再按照体积比为30-50％量取超纯水来配制甲酸乙腈-水溶液提取液；按照重量比为4:4:1来称取Na

(2)称取5.0g(精确到0.01g)粉碎后的待测样品于50mL离心管中，加入超纯水和提取剂后，再加入净化剂A组分用混合器混匀2-3min后，再用超声波提取5-15min，以8000-12000转/分钟冷冻离心一段时间；

(3)将步骤(2)冷冻离心后的离心管的试样的上清液转移至另一离心管中，然后在上清液中加入净化剂B组分，混合器混匀2-5min后，以8000-12000转/分钟冷冻离心5-10min；

(4)将步骤(3)冷冻离心后的试样的上清液采用0.22μm有机滤膜进行过滤后，进行分析备用；

(5)将步骤(4)的处理后的待分析样采用UPLC-MS/MS对其多组分的真菌毒素进行定性定量分析。

步骤(5)所测定的真菌毒素包括AFTB1、OTA、T-2、HT-2、ST、FB1和ZEN、NIV、DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON。

所述AFTB1、OTA、T-2、HT-2、ST和FB1的毒素采用ESI

步骤(3)中的UPLC-MS/MS的液相色谱柱为包括但不限于C18色谱柱，所述C18色谱柱长度为100mm-250mm，其中正离子采用浓度为0.01％-0.5％的甲醇-乙腈作流动相，负离子采用浓度为0.01％-0.5％氨水-甲醇作流动相。

所述步骤(2)和步骤(3)的混合器为涡旋混合器。

步骤(2)中的待测样品包括但不限于黄豆、绿豆、菜豆、小豆、芸豆、豌豆、豆腐、豆腐乳及其他的豆腐制品。

本实施例中所用实验辅助设备主要有万分之一天平(梅特勒，型号：B714929749)、十万分之一天平(梅特勒，型号：XSE105)、超声波清洗器(中晟科技，型号：SD290H)、高速冷冻离心机(凯特实验仪器，型号：TCL16M)、恒温震荡提取仪(莱伯泰科，型号：LW20)；实验所用主要检测仪器为液相色谱质谱联用仪(AB SCIEX，型号：TRIPLE QUAD 4500)，所用液相色谱质谱联用仪控制参数如下：

1、液相色谱参数

1)液相色谱柱：月旭UHPLC AQ-C18柱(柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.8μm)，或等效柱。

2)色谱柱温度：30℃。

3)进样量：正离子化合物(ESI+)2μL，负离子化合物(ESI-)3μL，如果是采用正负切换扫描模式，进样量可统一选用5μL。

4)流速：0.3mL/min。

5)流动相：A相：0.05％甲酸水溶液(ESI+)/0.05％氨水(ESI-)；B相：乙腈(ESI+)/甲醇(ESI-)。如果是在正负离子切换模式下同时进行真菌毒素检测，A相：0.1％甲酸+2mmol/L乙酸铵溶液；B相：乙腈。

6)使用真菌毒素标准溶液(浓度为100ng/mL)，通过C18色谱柱对其进行色谱分离，观察色谱峰的出峰时间、峰展宽以及离子响应值，调整优化洗脱程序，优化后的梯度洗脱程序见表1和表2。

表1：正离子模式液相色谱梯度洗脱程序

表2：负离子模式液相色谱梯度洗脱程序

2、质谱参数

1)离子源：电喷雾离子源。

2)质谱扫描模式：多重反应监测模式(MRM)。

3)离子化电压：正离子模式(EIS+)+5500V/负离子模式(EIS-)-4500V。

4)气帘气(CUR)：35psi。

5)离子源温度：500℃。

6)喷雾气(GS1)：50psi。

7)辅助加热气(GS2)：50psi。

8)采用针泵恒流方式进样，分别对11种真菌毒素的标准溶液(浓度为100ng/mL)进行一级质谱全扫描(Q1 Scan),确定各种真菌毒素母离子质荷比；通过氮气碰撞产生碎片离子进行二级质谱扫描(Product Ion Scan)，选择响应值最大碎片离子的作为定量离子，次级响应离子作为子离子，同时优化去簇电压(DP)和碰撞能量(CE),所得最佳质谱参数见表3和表4。

表3：5种负离子模式真菌毒素的质谱参数

注：*表示定量子离子。

表4：6种正离子模式真菌毒素的质谱参数

注：*表示定量子离子。

3、配制浓度为100ng/mL的真菌毒素混合标准，采用优化后的液相色谱质谱方法进行MRM质谱扫描，得到6种真菌毒素的总离子流图和色谱图，分别如附图1和图2所示。

4、以空白样本作为基体，按低、中、高浓度水平分别添加6种真菌毒素，添加浓度(a)、(b)、(c)分别为5、50、200μg/kg，如附图3所示。

5、使用空白溶剂(20％甲醇水溶液)，分别配制6种真菌毒素的混合标准曲线，其中负离子化合物的标准曲线浓度点为10、20、30、50、100、150、200ng/mL；正离子化合物的标准曲线浓度点为1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL，所得标准曲线如附图4(1)和附图4(2)所示。

6、样本提取方法开发

1)提取溶剂和提取方式考察

①、提取溶剂考察：选取空白样品，通过真菌毒素添加回收率(加标浓度为100μg/kg)分别考察不同提取液对6种真菌毒素的提取效率,每个加标样本做3个平行样，取平均值计算回收率，回收率在80％-120％，提取效率较好，结果表明1％的甲酸乙腈对真菌毒素的整体提取效果较好，如附图5所示。

②、提取方式考察：选取空白样品，通过真菌毒素添加回收率分别(加标浓度为100μg/kg)考察提取时间(10、20、30、60min)、提取方式(震荡提取、超声提取)对6种真菌毒素的提取效率,每个加标样本均做3个平行样，计算回收率，回收率在80％-120％，表明提取效率较好，结果表明震荡提取10min和超声提取10min均能较好的提取真菌毒素，出于简便，本方法采用超声提取10min，如附图6所示。

2)净化剂A用量考察

本实验方案通过真菌毒素添加回收率(加标浓度为100μg/kg)分别考察了Na

3)净化剂B用量考察

本实验方案通过真菌毒素添加回收率(加标浓度为100μg/kg)分别考察了MgSO4、PSA、C18，回收率80％-120％，表示提取效果较好，并根据回收率选择MgSO4、PSA、C18的用量，综合考虑MgSO4、PSA、C18的用量分别为600mg、400mg、200mg，考察结果如附图8(1)、附图8(2)、附图8(3)所示。

7、对本发明的方法的基质效应、线性关系、检出限、准确度和精密度进行验证考察，其结果如下：

1)基质效应考察

采用本方案所开发的净化剂A、净化剂B和提取试剂提取空白基质溶液，并配制标准曲线，以基质匹配标准曲线斜率和有机溶剂标准曲线斜率之比K来评价基质效应，若K值介于0.9～1.1之间，基质效应不明显，K大于1.1时为基质增强效应，小于0.9则是基质抑制效应，实验分别对8种基质中的6种真菌毒素进行了基质效应考察，除DON表现为基质抑制效应外，其他真菌毒素基质效应均不明显，为保证检测结果的准确性，DON在测定时可通过内标法消除基质效应，考察结果见表5。

表5-1:15-AcDON在8种基质中的基质效应考察

表5-2:3-AcDON在8种基质中的基质效应考察

表5-3:DON在8种基质中的基质效应考察

表5-4:ZEN在8种基质中的基质效应考察

表5-5：OTA在8种基质中的基质效应考察

表5-6:AFTB1在8种基质中的基质效应考察

2)线性关系、检出限和定量限考察

如表6所示，15-AcDON、3-AcDON、DON、ZEN均在10-300μg/L范围内具有良好的线性关系，OTA和AFTB1在1-200μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数R均不小于0.9992。采用本方案对低浓度加标的空白样品测定10次，检测结果的标准偏差为s，以样品空白值+4.65s为检出限(LOD)，以3倍LOD作为定量下限(LOQ)，6种真菌毒素在不同基质中的检出限在0.3-16.3μg/kg，检出限满足GB13078－2017限值要求。

表6：6种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数(r)、检出限和定量限

3)准确度和精密度考察

本发明根据不同样本基质采用(低、中、高)不同加标量分别对6种真菌毒素进行准确度考察，其中15-AcDON、3-AcDON、DON和ZEN 4种真菌毒素的添加水平(低、中、高)分别为20、100、400μg/kg，OTA和AFTB1的添加水平(低、中、高)分别为2、10、100μg/kg，每个添加水平均测定3次，取平均值，其平均回收率在81.5％-119％，均具有较好的回收率，结果见表7。本方案还通过选取不同基质进行加标实验，每个样本重复测定7次，通过计算相对标准偏差，得到精密度在0.53-2.51％，结果见表8。

表7：不同基质中6种真菌毒素的准确度考察

表8：不同基质中6种真菌毒素的精密度考察

本发明所配制的提取剂、净化剂A和净化剂B配制过程简单、通用性强、价格低、提取和净化耗时短、对环境友好，可同时满足多类样品的提取和净化。所使用的UPLC-MS/MS方法选择性强、样品分离度好、定量定性准确，通过对本方法的基质效应、线性关系、检出限、准确度和精密度进行验证考察，均能满足分析方法确认要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。