人RBP胶体金免疫层析定量检测试纸卡及其临床应用

摘要

本发明涉及人视黄醇结合蛋白胶体金免疫层析定量检测试纸卡及其临床应用。本发明制备了多种人视黄醇结合蛋白抗体，并进行配对筛选，最终获得了灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(B08及B14)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人临床样本检测的人视黄醇结合蛋白的胶体金定量检测卡，并可满足人血液或尿液样本的临床检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及两种抗人视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP)抗体及其制备方法以及上述抗体在人视黄醇结合蛋白胶体金免疫层析定量检测中的应用。

背景技术

视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP)由一条多肽链及小部分碳水化合物组成，分子量约21KD，半衰期3～12小时。RBP主要由肝脏合成，具有从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中，RBP与视黄醇、前白蛋白以1:1:1(mol)的复合物形式存在，转运体内90％的视黄醇至机体组织。当RBP与细胞表面的RBP受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的RBP从肾小球滤出，其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收并被分解，供组织利用，仅少量从尿中排出。体内锌、铁缺乏及严重感染等疾病能降低RBP的生物合成。

在蛋白质营养不良时，肝的蛋白质合成不足并引起RBP不足，视黄醇不能进入血液，视黄醇对RBP的分泌起调节作用，两者呈正相关。RBP与前白蛋白一起参与维生素A的转运，血清RBP和血清维生素含量具有高度相关性，因此认为RBP可作为反映维生素A缺乏的敏感指标。另有研究表明，血清RBP水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标。测定视黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏的反映肾近曲小管的损害程度，还可作为肝功能早期损害和监护治疗的指标。临床中，血清RBP定量检测可用于各科室，如肾病科、ICU、急诊科、内分泌科、消化科、老年科、儿科等。

综上，制备抗人视黄醇结合蛋白特异性抗体并应用于制备人视黄醇结合蛋白定量检测试剂盒具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组能有效的、特异性结合人视黄醇结合蛋白的抗体。更具体地说：

本发明的第一目的在于提供两种抗人视黄醇结合蛋白抗体。

第一种抗人视黄醇结合蛋白抗体(B08)，

其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

优选的是本发明中的第一种抗人视黄醇结合蛋白抗体(B08)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

第二种抗人视黄醇结合蛋白抗体(B14)，

其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；

以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

优选的是本发明中的第二种抗人视黄醇结合蛋白抗体(B14)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

本发明第二个目的是提供两种单链抗体，分别是单链抗体B08的氨基酸序列如SEQID NO:33所示，其核苷酸序列经优化后如序列SEQ ID NO：35所示；单链抗体B14的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，其核苷酸序列经优化后如序列SEQ ID NO：36所示。

本发明第三个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。

本发明第四个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主菌。

本发明第五个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：

1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；

2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。

本发明的第六个目的在于提供上述抗人视黄醇结合蛋白抗体在检测人视黄醇结合蛋白含量中的应用。

本发明的第七个目的在于提供一组可进行配对并检测人视黄醇结合蛋白的抗体对组合；且检测灵敏度高，特异性好。

本发明的第八个目的在于提供一种利用所述抗人视黄醇结合蛋白抗体检测人视黄醇结合蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体B14，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体B08，质控带位置包被抗His标签抗体或Protein L。所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所述抗His标签抗体优选鼠抗His抗体。

本发明制备了多种单克隆抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的一组抗体组合(B08及B14)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血液或尿液样本检测的人视黄醇结合蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。

附图说明

图1.抗体B08和B14重链及轻链可变区基因电泳图。Lane 1为B08轻链可变区PCR扩增基因，Lane 2为200DNA Ladder，Lane 3为B08重链可变区PCR扩增基因，Lane 4为B14轻链可变区PCR扩增基因，Lane 5为B14重链可变区PCR扩增基因。

图2.单链抗体结构示意图。V_H表示重链可变区序列，V_L表示轻链可变区序列，His标签为六个组氨酸。

图3.单链抗体表达PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图3-a为B08基因PCR产物；图3-b为B14基因PCR产物。

图4.单链抗体特异性检测效果图(Western Blot)。图4-a为抗体B08；图4-b为抗体B14。

图5.本发明胶体金免疫层析定量检测卡结果示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为金标垫、7为PVC片材。

图6.RBP检测卡(B08-B14)拟合曲线图，其中标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.008x+0.109，其中相关系数R²＝0.998。

图7.RBP检测卡(B08-B14)线性范围图，其中，标准曲线方程为y＝0.793x-3.347，相关系数为R²＝0.980。

图8.RBP检测卡(B08-B14)方法学比对

具体实施方式

定义

“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。

“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将V_L的N端连接至V_H的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。

互补决定区(complementarity-determining region,CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。

实施例1.抗人视黄醇结合蛋白杂交瘤细胞株的制备

1.动物免疫

以重组人视黄醇结合蛋白(大肠杆菌重组表达，本公司制备)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。

2.细胞融合

(1).脾脏细胞的制备

将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。

(2).饲养细胞的制备

取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中备用；

取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。

(3).细胞融合

选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约10⁸个上述脾细胞与2×10⁷个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。

将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。

3.抗人视黄醇结合蛋白特异性杂交瘤株筛选

(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组人视黄醇结合蛋白(大肠杆菌系统表达，本公司制备)至1μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的PBST缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。

(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株R08及R14均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。

实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定

对上述杂交瘤细胞株R08及R14抗体可变区序列进行测定。

a.RNA的提取：参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株R08及R14进行总RNA提取并立即进行反转录；

b.RNA反转录成为DNA：参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNASynthesis Kit(购自Thermo公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；

c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠IgG亚型单克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)进行回收，见附图1；

d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD18-T kit(购自Takara公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

测序得到杂交瘤细胞株R08的抗体B08重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ IDNO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

测序得到杂交瘤细胞株R14的抗体B14重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ IDNO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

实施例3.单链抗体的重组表达及纯化

根据实施例2中测序结果，将杂交瘤细胞株R08及R14的抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(GGGGS)₃，引入六个组氨酸，并将其全基因进行人工合成，构建到毕赤酵母中进行单链抗体的重组表达，所表达得到的抗体分别命名为抗体B08及B14，其结构组成如附图2所示。上述单链抗体的重组表达具体如下：

1.融合蛋白基因的表达质粒构建

密码子优化后的抗体B08的基因序列如SEQ ID NO:35所示、氨基酸序列如SEQ IDNO:33所示；密码子优化后的抗体B14的基因序列如SEQ ID NO:36所示、氨基酸序列如SEQID NO:34所示。将人工合成的抗体B08，B14的基因片段上游引入pPICZαA载体中XhoI序列酶切位点，下游引入XbaI酶切位点，构建到pMD19-T Simple Vector质粒(购自Invitrogen公司)中，得到一种长期保存质粒，质粒记为pMD19-B08-scFv-(HIS)₆、pMD19-B14-scFv-(HIS)₆。进行PCR扩增，其中上游引物P1为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；下游引物P2为:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳分析(附图3)，显示产物大小与预期大小一致。分别将PCR获得基因产物回收纯化后，采用XhoI(#R0146S,购自NewEngland>6、pPICZα-B14-scFv-(HIS)₆。

2.融合蛋白基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达

YPDS固体培养基配制：参照Invitrogen公司EasySelectPichia Expression Kit说明书；毕赤酵母感受态细胞：参照EasySelectPichia Expression Kit说明书；BMGY培养基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书；BMMY培养基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书。

分别将pPICZα-B08-scFv-(HIS)₆、pPICZα-B14-scFv-(HIS)₆质粒，用SacI限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到X-33感受态酵母细胞，涂布到含有Zeocin的YPDS固体培养基，30℃培养3-5天，就有阳性克隆产生。

挑取上述获得的单克隆于5mL BMGY培养基中，30℃培养至OD₆₀₀＝2.0～6.0时，取1mL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到BMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％(v/v)。一周后，离心收集菌液上清，通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析(Western>

将上述获得的B08及B14重组融合蛋白基因工程菌株接种于BMGY培养基中，30℃，220rpm培养至菌体密度到OD₆₀₀＝2.0～6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)。一周后，收集发酵培养液。

3.融合蛋白纯化

采用组氨酸标签亲和柱纯化抗体B08及B14融合蛋白，预装柱子选择为HisTrap HP(17-5248-02,购自GE healcare公司)，具体步骤如下：

发酵液的除杂预处理：将上述表达得到抗体B08及B14融合蛋白发酵液上清，离心收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mMNaCl，20mM NaH₂PO₄，20mMImidazole，调pH7.5，0.45μm滤膜过滤。

HisTrap HP亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTAavant150，购自GEhealcare公司)对预处理获得的抗体B08及B14融合蛋白发酵液进行亲和纯化，柱子为HisTrap HP。结合缓冲液为300mMNaCl，20mMNaH₂PO₄，20mM>2PO₄，500mM>

实施例4.抗体的性能评价

1.抗体B08及B14的Western blot鉴定

a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置12％分离胶、5％浓缩胶，分别上样标准蛋白质及重组人视黄醇结合蛋白蛋白(大肠杆菌系统表达，本公司制备)，恒压下电泳1小时；

b.转膜：恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，观察蛋白的残留情况；

c.封闭：含5％脱脂奶的TBST缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(TBST，详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；

d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:1000体积比)辣根过氧化物酶标记B08(B08-HRP，1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)及辣根过氧化物酶标记B14(B14-HRP，1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)，分别加入上述两张硝酸纤维素膜中，室温反应1小时；TBST洗涤5次，每次10分钟；

e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，硝酸纤维素膜加入2mL稳定型过氧化物酶溶液(1mL)与鲁米诺/增强剂溶液(1mL)的混合液(购买于Thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统(购买于GE公司)拍照，留取结果。

检测结果可见，抗体B08及B14均具有较好的特异性，可特异性检测人视黄醇结合蛋白蛋白。

3.单链抗体B08及B14在胶体金检测平台的评价

将实施例3中纯化的抗体进行配对组合，分别作为包被抗体或标记抗体进行配对检测视黄醇结合蛋白(RBP)，检测步骤如下：

1)用抗体包被液将B08或B14稀释至1mg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；

2)用0.01M PB缓冲液将胶体金标记的B08或B14稀释后喷与结合垫上；

3)按附图所示贴膜，切条，装卡(具体制备参见实施例5)

4)用样本稀释液稀释RBP标准品(大肠杆菌重组表达)，至浓度为150mg/L，16mg/L，将这两个浓度标准品和零浓度标准品(即样本稀释液)分别添加50ul到胶体金检测卡中(B08包被-B14标记或B14包被-B08标记)，10min后将检测卡放置在读数仪上进行读数。结果如下表所示：

由上述结果可知，可见B08作为包被抗体，B14作为标记抗体组成的双抗体夹心法检测系统可应用于胶体金检测平台，进行RBP的检测。

实施例5抗人视黄醇结合蛋白的胶体金免疫检测卡的制备

1、溶液配制

1)0.01M PB缓冲液制备：称取Na₂HPO₄·12H₂O>2PO₄·2H₂O>

2)0.01M PBS缓冲液制备：称取Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，NaCl8g，KCl0.2g加纯化水1000ml，转子搅拌至溶解，用pH计测定其pH7.4±0.1，0.45um滤膜过滤。

2)封闭液制备：称取牛血清白蛋白5g，加0.01M PB溶液(pH7.4±0.1)50ml，转子搅拌至溶解。

3)抗体包被液制备：取0.05g牛血清白蛋白，加入10ml 0.01M PBS溶液(pH7.4±0.1)，转子搅拌5-10min。

4)金标抗体复溶液制备：称取1g牛血清白蛋白，5g海藻糖，加入100ml 0.01M PB溶液(pH7.4±0.1)，转子搅拌至溶解后，加入25ul Tween-20，继续用转子搅拌5-10min。

5)样本稀释液制备：取500ml 0.01M PBS溶液(pH7.4±0.1)，加入0.5mlProclin300，转子搅拌至溶解。

2、人视黄醇结合蛋白胶体金检测卡制备

1)胶体金的标记

抗体B14的胶体金标记(以1ml胶体金溶液标记为例)：用K₂CO₃调节胶体金pH值(每1ml胶体金中加入10ul>2CO₃)，搅拌5-10分钟，向胶体金溶液中缓慢加入抗体B14(每1ml胶体金中加入5ug抗体B14)，低速搅拌30分钟；加入封闭液BSA至其终浓度为10％(质量百分比)，搅拌20分钟；静置30min后12000rpm离心30min；去上清用100ul金标抗体复溶液复溶沉淀即得胶体金标记的B14抗体。

2)金标垫及反应膜制备

将B14金标抗体喷涂在金标垫6上，干燥备用；

将抗体B08用抗体稀释液稀释至1.0mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的T线5位置；将抗His标签抗体用抗体稀释液稀释至0.2mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的C线4位置，反应膜干燥备用。

3)贴膜、切膜、组装

将样品垫1、金标垫6、包被有抗体的硝酸纤维素膜2、吸水垫3从左至右依次设置(如图5所示)，且两两之间应少许接触，所述包被有抗体的硝酸纤维素膜的T线5在左、C线4在右，并根据外壳大小进行切割，装入外壳，完成检测卡制备。

4)试剂盒组装

将组装好的检测卡，干燥剂装入铝箔袋中，热封机封口，贴标签；

将样本稀释液按1ml/管进行分装，并按照试剂盒规格装入自封袋，贴标签；

按照成品规格，将一定份数的内包，1个含样本稀释液的自封袋，1份说明书，1个合格标签装入包装盒内，并在包装盒外贴好标签。

3、人视黄醇结合蛋白胶体金检测卡使用方法

1)打开外包装，从密封铝箔袋中取出检测卡，置于平坦台面上。

2)吸取10μl血清/血浆样本，加入样本稀释液A中充分混合，从中吸取10ul混合液加入到B管样本稀释液中，充分混合。

3)吸取40ul经处理后的样本加入检测卡的加样孔中，室温下静置10min。

4)将检测卡放入免疫层析定量分析仪中，按“快速检测”键开始检测，仪器将自动对检测卡进行扫描。

5)从免疫层析定量分析仪的显示屏幕上读取/打印检测结果。

4、人视黄醇结合蛋白胶体金检测卡检测效果评估

1)精密性：将B08(包被)-B14(标记)检测卡按检测卡使用方法检测16、150mg/L的RBP参考品各10次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示三个浓度检测结果变异系数CV<15％。

浓度点(mg/L)16150CV11.24％8.56％

2)检测范围：将B08(包被)-B14(标记)检测卡检测不同浓度的RBP重组蛋白5.625、11.25、22.5、45、90、180mg/L，拟合曲线及检测范围为8-180mg/L(如附图6)。

3)线性范围：将高值样本与样本稀释液按照一定比例配制成5个系列浓度样本，用B08(包被)-B14(标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果与理论浓度进行回归统计，判断在该浓度范围内是否成线性。线性范围为8-180mg/L(如附图7)。

4)准确度：将B08(包被)-B14(标记)检测卡按检测卡使用方法检测16、150mg/L的RBP参考品各3次重复，计算平均值和理论值的相对偏差，实验结果显示三个浓度检测结果相对偏差B<15％。

浓度点(mg/L)16150B9.78％5.67％

5、准确度—方法学比对：

选择同类产品中目前市场上获得良好信誉的重庆中元生物技术有限公司视黄醇结合蛋白检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)作对照产品比对验证。选择30份临床病人标本，按1到30的顺序编号，用对照产品和待评价的B08(包被)-B14(标记)的胶体金检测卡同时进行实验，按照1，2，3......28，29，30，30，29，28......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待评价产品的检测结果相关系数R²＝0.99，说明两种方法检测结果有较好的相关性(如附图8)。

5、配方筛选

除上述最优制备例1外，申请人还尝试多种制备方案，例如下面几组检测卡制备及应用结果如下表：

序列表

<110> 江苏晶红生物医药科技股份有限公司 江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120> 人RBP胶体金免疫层析定量检测试纸卡及其临床应用

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 1

Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ala Arg Ser Pro Pro Leu Tyr Phe Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp

1 5 1015

Tyr

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Ser Ser Val Asn Ser Ser Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Ser Thr Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 124

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr

202530

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Glu Tyr Ser Glu Met Phe

505560

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

859095

Ala Arg Ser Pro Pro Leu Tyr Phe Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Gln Ile Val Leu Thr His Ser Pro Pro Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 1015

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Asn Ser Ser Val Asn Ser Ser

202530

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

354045

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

505560

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65707580

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

859095

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr Trp

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Ile Asp Gly Tyr Asp Ser Glu Thr

1 5

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Ala Arg Ser Gly Ala Val Glu Gly Arg Tyr Ser Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Glu Ser Val His Ser Tyr Gly His Ser Phe

1 5 10

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Arg Ala Ser

1

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr

1 5

<210> 15

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 1015

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr

202530

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Arg Ile Asp Gly Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Thr Gln Tyr Phe

505560

Arg Asp Lys Ala Met Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Ser Gly Ala Val Glu Gly Arg Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 1015

Gln Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val His Ser Tyr

202530

Gly His Ser Phe Met His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

354045

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val

505560

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65707580

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

859095

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 17

ggctacagct tcacaaggta ctat 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 18

atttttcctg gaagtggtaa tact 24

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 19

gcaagaagcc cccccctcta ctttggtaac tacgaggggg ctatggacta c 51

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 20

tcaagtgtaa attccagtta c 21

<210> 21

<211> 9

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 21

agcacatcc 9

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 22

accagtatca tcgttccccg ctcacgt 27

<210> 23

<211> 372

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 23

caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca aggtactata tacactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaagtggtaa tactgagtac 180

agtgagatgt tcaaggacaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaagcccc 300

cccctctact ttggtaacta cgagggggct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accgtctccg ca 372

<210> 24

<211> 325

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 24

caaattgttc tcacccattc tccaccaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccaactc aagtgtaaat tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gcccgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcac cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgct cacgttcggt 300

gctgggacca agctggaaat caaac 325

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 25

ggctacaggt tcaccgacta ctgg 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 26

attgatggtt acgatagtga aact 24

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 27

gcaagatctg gggcagtaga agggaggtat tctatggact ac 42

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 28

gaaagtgttc atagttatgg ccatagtttt 30

<210> 29

<211> 9

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 29

cgtgcatcc 9

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 30

aacaaagtaa tgaagatcct cggacgt 27

<210> 31

<211> 363

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 31

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ttggtgaggc ctgggacttc tgtgaaactg 60

tcctgcaagg cttctggcta caggttcacc gactactgga tgaactgggt taagcagagg 120

cctgaccaag gccttgagtg gattggaagg attgatggtt acgatagtga aactcactac 180

actcaatact tcagggacaa ggccatgttg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatctggg 300

gcagtagaag ggaggtattc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360

tca 363

<210> 32

<211> 334

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 32

gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

gtatcctgca gagccagtga aagtgttcat agttatggcc atagttttat gcactggtac 120

cggcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa tcttgaatct 180

gggatccctg tcaggttcac tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccattaat 240

cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcaac aaagtaatga agatcctcgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gttggaaata aaac 334

<210> 33

<211> 247

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr

202530

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Glu Tyr Ser Glu Met Phe

505560

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

859095

Ala Arg Ser Pro Pro Leu Tyr Phe Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

130 135 140

His Ser Pro Pro Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met

145 150 155 160

Thr Cys Thr Ala Asn Ser Ser Val Asn Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr

165 170 175

Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser

180 185 190

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala

210 215 220

Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala

225 230 235 240

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 34

<211> 247

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 34

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 1015

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr

202530

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Arg Ile Asp Gly Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Thr Gln Tyr Phe

505560

Arg Asp Lys Ala Met Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Ser Gly Ala Val Glu Gly Arg Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg

145 150 155 160

Ala Ser Glu Ser Val His Ser Tyr Gly His Ser Phe Met His Trp Tyr

165 170 175

Arg Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser

180 185 190

Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala

210 215 220

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly

225 230 235 240

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 35

<211> 742

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 35

caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca aggtactata tacactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaagtggtaa tactgagtac 180

agtgagatgt tcaaggacaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaagcccc 300

cccctctact ttggtaacta cgagggggct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accgtctccg caggtggcgg agggtctggt ggcggagggt ccggtggcgg agggtcacaa 420

attgttctca cccattctcc accaatcatg tctgcatctc taggggaacg ggtcaccatg 480

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gaagatgctg ccacttatta ctgccaccag tatcatcgtt ccccgctcac gttcggtgct 720

gggaccaagc tggaaatcaa ac 742

<210> 36

<211> 742

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 36

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ttggtgaggc ctgggacttc tgtgaaactg 60

tcctgcaagg cttctggcta caggttcacc gactactgga tgaactgggt taagcagagg 120

cctgaccaag gccttgagtg gattggaagg attgatggtt acgatagtga aactcactac 180

actcaatact tcagggacaa ggccatgttg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatctggg 300

gcagtagaag ggaggtattc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360

tcaggtggcg gagggtctgg tggcggaggg tccggtggcg gagggtcaga cattgtgctg 420

acccagtctc cagcttcttt ggctgtgtct ctagggcaga gggccaccgt atcctgcaga 480

gccagtgaaa gtgttcatag ttatggccat agttttatgc actggtaccg gcagaaacca 540

ggacagccac ccaaactcct catctatcgt gcatccaatc ttgaatctgg gatccctgtc 600

aggttcactg gcagtgggtc tgggacagac ttcaccctca ccattaatcc tgtggaggct 660

gatgatgttg caacctatta ctgtcaacaa agtaatgaag atcctcggac gttcggtgga 720

ggcaccaagt tggaaataaa ac 742